核酸检测原理及血站流程.pptxVIP

核酸检测技术及血站检测核酸流程应用支持中心 曲贤敏 2015年1月核酸检测技术核酸是什么,为什么要检测核酸是如何被检测到的核酸检测优点(现对于ELISA)核酸检测前提病毒是什么 HBV DNA HCV RNA HIV RNA核酸是如何检测的病毒核酸有病毒外壳(提取核酸)进行扩增至检出水平(扩增)扩增时增加荧光标记 (荧光定量)检测荧光量(结果)核酸检测的技术优点灵敏度HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml特异性核酸的特异性高，几乎没有方法学假阳性但要防止污染内标（内对照）为避免假阴性，要求每管阳性质控自动化大规模、高通量灵敏度宣传灵敏度是指单人份的检测实际灵敏度=宣传灵敏度*Pooling数灵敏度是IU单位,其他无可比性HCV,HIV窗口浓度高,要求灵敏度比HBV要低与取样几率有很大关系(低病毒浓度)内标控制内标的定义(InnerControl) 人工合成的小段DNA片段,随样本一起进行提取扩增.内标作用 内标是PCR检测目标基因的必需成分,防止假阴性,提高检测灵敏度的重要指示.内标会对整个核酸检测过程的一个监控,包括样本的提取,荧光扩增,及反应液的配制,PCR的抑制因素等.内标与ELISA的阴阳性对照有区别核酸对比酶免优点?病毒变异免疫静默期实验操作失误病毒感染的窗口期项目ELISA窗口期项目NAAT窗口期HBsAg56HBV25抗-HCV72HCV59抗-HIV22HIV11血站核酸检测流程标本采集标本保存标本制备核酸提取核酸扩增检测结果分析标本采集保存采血车上采血之后,立即进行冷冻离心HCV半衰期只有4小时2-8度保存上机前再次离心核酸提取(磁珠法)样本汇集(有/没有)裂解结合洗涤磁珠加热洗脱汇集什么是汇集为什么要汇集汇集的优缺点裂解结合细胞裂解：破碎细胞膜及核膜.病毒裂解: 破碎病毒外壳(蛋白质).核酸结合: pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合 洗涤磁珠洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离. 干扰物通常是血液中的其他蛋白质 洗涤最后一步通常为酒精,干燥或者纯水冲洗.洗脱核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来。(不完全被洗脱) 洗脱液量比较少的情况下,洗脱效率会略提高.扩增检测检测三项(多重,单项)PCR/TMA分析数据TMATMA与PCR比较结果判读一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。CTCT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数此数值由厂家经过大量实验测定.问题血站检测为什么无TP?血站大部分用汇集?血小板是否使用核酸检测时效性:酶免2小时,核酸8小时汇集or拆分?每次献血都进行检测?核酸一旦检出阳性是否发血?厂家宣传的灵敏度均指单人份检测，而非推荐pooling方案的实测灵敏度实际应用灵敏度=宣传灵敏度×pooling数IU才有可比性：WHO标准品以及国家一级标准品均以IU为单位HCV、HIV窗口期浓度高，因此对灵敏度要求较低。美国FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被检出HBV的窗口期标本在30-300IU/ml之间，因此对灵敏度要求高低于灵敏度也有检出的可能，这与取样几率有关无偿献血的新动态“定期无偿献血者是低危的献血者”，但是“以体检为目的定期无偿献血者是高危献血者”而且这部分人群的献血队伍正在扩大。这部分人群窗口期的机率高于其他人群。因为在他们中间高危的传播行为经常发生。经过治疗后的HBsAg转阴，ELISA方法检测阴性的献血者。