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动物荧光定量PCR检测方法 动物荧光定量PCR检测方法 动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒 一、实验前准备 （一）、分装反应液（以鸡鸭源为例） １、将反应液（GA ）与Bst 聚合酶离心15s ，取出，在反应液中加入Bst 聚合酶全部加入到反应液（GA ）中离心15s ，将其分装小管中，每个管分23μL 。一般分到24-26个。 2、分装完毕，取密封液加入每个小管中各一滴（所取密封液的枪一定要竖直加入）。 3、全部完毕后将其和试剂盒放到-20℃冰箱中保存。: 注：①每一种试剂盒中，出来反应液与对应的阳性对照不可混用外，其他三种均可通用。 ②每一试剂盒中都有反应液、Bst 聚合酶、密封液、阴阳对照五种试剂。 （二）、试验中试剂的准备 1、Proteinase K：加入600μL Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中，颠倒混匀使蛋白酶K 充分溶解，保存于-20℃。 2、Buffer GW1：加入14mL 无水乙醇。 3、Buffer GW2：加入40mL 无水乙醇。 注：每一种试剂盒上都有相应的说明。Buffer GW1和Buffer GW2加入无水乙醇的量按说明书操作。 二、动物组织DNA 提取 1、取30-100μL Buffer AE（这是一个样品的量，具体量取决于自己做的实验样品的个数），于70℃中预热，备用。 2、取1-20mg 的样品，将其剪切成尽量小的碎片，转移到1.5mL 的离心管中。加入230μL Buffer MTL和20μL Proteinase K，涡旋混匀。55℃水浴1-3h （具体时间看样品的消化情况）。水浴期间要时常将样品涡旋混匀。 注意：取样量不可以太多，过多会降低产量与纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA ，不宜超过10mg 。肌肉和皮肤可相应增加到30mg 。 3、加入5μL RNase Solution（RNA 裂解酶）（枪身不要碰着RNase Solution）至消化液中，涡旋混匀。室温或37℃水浴锅中放置15-60min 降解RNA 。 4、13000r 离心3min 。取上清液至新的1.5mL 的离心管中。 5、加入250μL Buffer AL 至消化液中，最高速度涡旋混匀30s 。70℃水浴 10min 。 6、加入250μL 无水乙醇至消化液中，最高速度涡旋混匀30s 。 7、把DePure gDNA Mini Column装入2mL 收集管中。转移6中的混合液（含沉淀）至柱子中。10000r 离心1min 。 8、倒弃滤液，把柱子装回收集管（转动一下突起拿下收集管）中。加入500微升Buffer GW1至柱子中，10000r 离心1min 。 9、倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500微升Buffer GW2至柱子中，10000r 离心1min 。 10、倒弃滤液，把柱子装回收集管中。再加入500微升Buffer GW2至柱子中，10000r 离心1min 。 11、倒弃滤液把柱子装回收集管。13000r 离心2min 去除柱子中残留的乙醇。 12、将柱子转移至新的1.5ml 离心管中。加入30-100μL 已经预热到65℃ Buffer AE 至柱子的膜中央（枪头靠近底部，打入即可，不要碰到底部。同时枪头不要碰到柱子）。室温静置3min 。10000r 离心60s 。 13、再加入30-100μL 已经预热到65℃ Buffer AE (量为第一次的一半即可) 至柱子的膜中央（枪头靠近底部，打入即可，不要碰到底部。同时枪头不要碰到柱子）。室温静置3min 。10000r 离心60s 。 14、丢弃DNA 结合柱，将DNA 保存于-20℃。备用。 注意：二过程中的每一步加液时，都不要吹打。拿离枪时，不要使枪放开。