3基因工程的基本条件-全课件课件.pptx

生物工程专业核心课程基 因 工 程第一页，编辑于星期五：点 四十分。基因工程1 基因工程的基本概念2 基因工程的基本原理3 基因工程所需的基本条件4 基因工程的操作过程5 目的基因的克隆与基因文库的构建6 大肠杆菌基因工程7 酵母基因工程8 哺乳动物基因工程9 高等植物基因工程第二页，编辑于星期五：点 四十分。3 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体C用于基因转移的受体菌或细胞第三页，编辑于星期五：点 四十分。3 基因工程的基本条件A用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶第四页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用hsd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III 第五页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶限制修饰多功能单功能双功能辅助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型II 型III 型蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处第六页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株H i n d III H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第七页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点EcoR I的识别序列5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’第八页，编辑于星期五：点 四十分。EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’EcoRI 37 ℃退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’POH第九页，编辑于星期五：点 四十分。PstI等产生的3‘粘性末端5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’PstI 37 ℃5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’退火 4-7 ℃OHP5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’POH第十页，编辑于星期五：点 四十分。5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’PvuII等产生的平头末端5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’PvuII 37 ℃第十一页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.50 - 50 mM 低盐酶MgCl210 mM100 mM 中盐酶NaCl0 - 150 mMDTT1 mM150 mM 高盐酶Volume20 - 100 mlT T37 ℃ 1 - 1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量第十二页，编辑于星期五：点 四十分。限制性核酸内切酶II 型限制性核酸内切酶酶解反