新型冠状病毒单克隆抗体及其应用发明专利.docxVIP

新型冠状病毒单克隆抗体及其应用 技术领域： 本发明属于单克隆抗体筛选和制备技术领域，具体涉及一种新型 冠状病毒单克隆抗体及其应用。 背景技术： SARS-Cov-2为线性单股正链的RNA病毒，其结构蛋白包括刺突 蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance， M)及核蛋白(nucleocapsid，N)。S蛋白由S1和S2亚基构成。 SARS-Cov-2通过病毒颗粒表面的刺突蛋白(spike蛋白，S蛋白) 与肺部上皮细胞表面的血管紧张素转化酶 2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)的膜蛋白结合，ACE2 随后发生形状结构的变化，导致病毒进入细胞内。基于新冠病毒致病 机制，通过S蛋白的中和抗体阻断S蛋白与细胞表面ACE2的结合， 从而阻断病毒进入细胞。 当SARS-Cov-2入侵体内时，会诱导机体产生相应的效应B细胞 和记忆B细胞，效应B细胞会产生抗体，该抗体可用于SARS-Cov-2 的诊断和治疗。从SARS-Cov-2康复者获得的血浆输入SARS-Cov-2重 症患者体内，症状可以得到明显改善。但是面对庞大数量的患者，SARS-Cov-2康复者血浆数量有限，可以通过筛选SARS-Cov-2康复者 体内针对SARS-Cov-2的有效中和抗体，通过基因工程和蛋白表达技 术，体外大规模生产单克隆抗体。 发明内容： 本发明的主要目的是提供针对SARS-Cov-2的特异单克隆抗体及 其应用。从SARS-Cov-2康复者体内获取单核细胞构建噬菌体库，快 速筛选到针对SARS-Cov-2特异性抗体，该抗体可用于新型冠状病毒 SARS-Cov-2的临床检测、诊断、预防和治疗。 为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现： 从SARS-Cov-2康复者体内抽取外周血，获取单核细胞并提取总 RNA,合成cDNA，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增重链 可变区和轻链可变区，获得的重链可变区和轻链可变区进行随机组合， 并与噬菌体载体进行重组，重组产物转化XL1-Blue，加入辅助噬菌 体VCSM13获得滴度≈10?13大小SARS-Cov-2噬菌体抗体库。使用抗原 S1或RBD，筛选出抗Fab的抗体，通过测序，获得能与S1或RBD结 合的重链可变区和轻链可变区序列，重链可变区组装上IgG1的Fc片 段，抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达，表达出全人源化抗 S1或RBD的抗体。通过体外亲和力测定及假病毒中和实验，筛选到 可用于SARS-Cov-2检测、诊断、预防或治疗用单克隆抗体。 本发明筛选到的新型冠状病毒抗体，包括XY1、XY2、XY3、XY4、 XY5、XY6、XY7、XY8、XY9、XY10、XY11、XY12、XY13、XY14、XY15， 15种抗体中的一种或多种。 本发明筛选到的： XY1抗体重链可变区包含: CDRH1氨基酸序列见SEQ ID NO.1； CDRH2氨基酸序列见SEQ ID NO.2； CDRH3氨基酸序列见SEQ ID NO.3； 优选XY1抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.4。 XY1抗体轻链可变区包含: CDRL1氨基酸序列见SEQ ID NO.5； CDRL2氨基酸序列见SEQ ID NO.6； CDRL3氨基酸序列见SEQ ID NO.7 优选XY1抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.8。 XY2抗体重链可变区包含: CDRH1氨基酸序列见SEQ ID NO.9； CDRH2氨基酸序列见SEQ ID NO.10； CDRH3氨基酸序列见SEQ ID NO.11 优选XY2抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.12。 XY2抗体轻链可变区包含: CDRL1氨基酸序列见SEQ ID NO.13； CDRL2氨基酸序列见SEQ ID NO.14； CDRL3氨基酸序列见SEQ ID NO.15； 优选XY2抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.16； XY3抗体重链可变区氨基酸序列包含： CDRH1氨基酸序列见SEQ ID NO.17； CDRH2氨基酸序列见SEQ ID NO.18； CDRH3氨基酸序列见SEQ ID NO.19； 优选XY3抗体重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.20。 XY3抗体轻链可变区氨基酸序列包含： CDRL1氨基酸序列见SEQ ID NO.21； CDRL2氨基酸序列见SEQ ID NO.22； CDRL3氨基酸序列见SEQ ID NO.23； 优选XY3抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.24。 XY4抗体重链可变区氨基酸包含： CDRH1氨基酸序列见SEQ ID NO.25； CDRH2氨基酸序列见SEQ ID NO.26； CDRH