分子生物学常用技术(简化版).pptx

篇：分子生物学技术(jìshù)与应用 第19章：分子生物学常用技术－－4学时 分子杂交、PCR、基因测序 蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交) 基因转移与基因剔除(含RNA干扰(gānrǎo)) 第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时 第一页，共98页。第十九章分子生物学常用(chánɡ yònɡ)技术第二页，共98页。分子生物学技术(jìshù)能帮助我们干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能细胞与整体水平：基因在活体中的功能目的(mùdì)：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段第三页，共98页。我们需要(xūyào)了解和掌握哪些基本技术？基本技术：核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用综合技术：基因工程技术转基因生物(shēngwù)与基因敲除技术应用技术：基因诊断基因治疗第四页，共98页。第一节：核酸分子(fēnzǐ)杂交Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补(hù bǔ)的未知核酸序列用途：确认核酸序列间同源性对特定核酸序列进行定量自核酸混合体中辨认特定核酸序列第五页，共98页。一、基本原理变性(denature)复性(fù xìnɡ)(renature)杂交(hybiridization)第六页，共98页。核酸(hé suān)变性在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程破坏氢键与疏水作用可导致(dǎozhì)变性热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时任何核酸双链都将变性酸碱变性：pH3 或 pH11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性第七页，共98页。变性(biànxìng)温度Tm：melting temperature，解链温度或变性温度影响变性温度的因素：溶液的离子强度(qiángdù)变性温度与离子强度(qiángdù) 正相关，低盐利于变性DNA分子的 GC 含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24第八页，共98页。核酸(hé suān)复性变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然(tiānrán)双螺旋结构的过程复性类似与化学反应，需要一定反应时间第九页，共98页。影响(yǐngxiǎng) DNA 复性速度的因素DNA 分子的浓度：浓度高，复性快DNA 分子的长度：长片段复性速度慢DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快不同物种C0t曲线(qūxiàn)比较 　人类基因组C0t曲线(qūxiàn)第十页，共98页。二、核酸(hé suān)探针Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列探针(tàn zhēn)为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链探针(tàn zhēn)必需经过标记：放射性标记或非放射性标记第十一页，共98页。1. 探针(tàn zhēn)有哪些种类？DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列(xùliè)或 cDNA 序列(xùliè)合成的探针，一般为双链，也可制备成单链RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测　人工合成的短序列(xùliè)(~20nt)，可自由选择序列(xùliè)第十二页，共98页。2. 标记(biāojì)物有哪些？标记物的要求：高度的灵敏性：足以(zúyǐ)检测到极微量的核酸序列高度的特异性：足以(zúyǐ)在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列标记物的种类：放射性同位素(radio isotope)非放射性标记物(non-radioactive label)第十三页，共98页。放射性同位素特点：灵敏度最高的标记物，足以检测(jiǎn cè)到飞克级微量的核酸序列 g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素第十四页，共98页。放射性标记(biāojì)的核苷酸单体dNTP or NTP5’ or 3’ P32 labelling第十五页，共98页。非放射性标记(biāojì)物特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素地高辛：通过地高辛抗体结合并检测(jiǎn cè)生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin)化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光电子密度标记物：金等重金属第十六页，共98页。3. 如何检测(jiǎn cè)杂交信号？同位素标记物：盖革计数器、液体闪烁(shǎn shuò)计数器放射自显影(autor