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医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 实验器材准备 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 革兰染色器材准备 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 医学微生物学实验综合性实验一 脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 显微镜油镜的使用 革兰染色法 肉汤接种法 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 斜面培养物的观察 分别从斜面的正面和背面观察。 从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。 ※为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到的菌落的颜色，紫黑色或粉红色。 从斜面上取菌时，不管是涂片，还是接种，每次只取半个小菌落大小的菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 显微镜油镜的使用P13 10×物镜→标本位置→滴加香柏油→100×油镜→浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源。 油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 →擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。 显微镜罩上防尘罩→ 横放在实验柜内。 ★(顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 ★（校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 细菌的显微镜检查法 显微镜：光学显微镜 目镜：10倍 物镜：油镜头（90或100倍） 放大倍数：10×90或100＝900或1000 镜油：香柏油或石蜡油 香柏油折射率（n＝1.515），玻片折射率（n＝1.52），石蜡油（n＝1.46），空气（n＝1.00）。 ★油镜使用完毕必须擦拭油镜头。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 100倍浸油物镜使用方法 油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。 旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。 如果浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜来回通过1～2次浸油，排除油内气泡。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 油 透镜 光线 载玻片 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 奥林巴斯 CX21型 生物显微镜 （实验柜内，每人一台） 注意：只能横放，不得竖放。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 细菌染色法 单染色法：只用一种染料染色，如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。 复染色法（鉴别染色）：采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。 革兰染色 抗酸染色 特殊染色 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 革兰染色gram stain 目的要求： 学习并初步掌握革兰染色法。 了解革兰染色法的原理，及其在细菌分类鉴定中的重要性。 革兰染色法是丹麦细菌学家Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有120多年的历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 革兰染色法原理的三种学说 通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫—碘复合物容易被酒精脱出。 等电学说：G+菌等电点(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料—媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 革兰染色的意义 鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。 选择抗菌药物：G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。 了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。 革兰染色的步骤 涂片 → 干燥 → 固定→ 染色 医学微生物学实验脓汁和粪便标本中病原菌检测 加生理盐水3 ～4ul，2滴。 菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。 涂毕→环移至涂膜 中央侧立，菌膜→ 破裂,接种环→灭菌。 涂片 甲，乙→黄色，紫黑。 丙，丁→白色，粉红。 医