分子病理学常用研究技术原理及应用PPT课件.ppt

IHC主要染色方法及原理 5S： specificity sensitivity simplicity safely save 直接法 间接法 PAP法 APAAP法 ABC法 —— 直接法（direct method） 用荧光素或酶标记的特异性抗体，直接与待检组织中的抗原反应，又称一步法 操作简单，特异性高而敏感性低 抗体需单独标记，生产成本高 最常用于肾活检组织及结缔组织病皮肤活检标本的IgG、IgA、IgM及补体等免疫相关蛋白的检测 也用于FCM测定各种细胞表面抗原 组织抗原 第一抗体 过氧化物酶 间接法（indirect method） 又称夹心法（sandwich method），分两步检测抗原或抗体。检测抗原时，先以未标记的特异性抗体（第一抗体）与组织或细胞中的抗原反应，洗去未结合的抗体后，再以酶或荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与第一抗体结合，再显色或荧光检查。 敏感性是直接法的3-5倍，但特异性有所降低 最大优点在于不必标记每种第一抗体，只需要标记数量有限的第二抗体，利于商品化生产 非标记抗体法 抗体与酶或荧光素结合不可避免地会降低抗体与抗原结合能力，并影响标记物本身活性 酶桥法（enzyme bridge technique） PAP法（peroxidase antiperoxidase method） APAAP法 亲和素-生物素法 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin biotin- peroxidase complex technique，ABC） ABC复合物由亲和素与酶标生物素以一定比例结合而成，亲和素作为桥梁，将ABC复合物与生物素化的抗体结合起来，再由抗体检出抗原 最大优点是敏感性高，背景干净，是目前应用最为广泛的免疫组化方法 亲和素-生物素法 酶标亲和素－生物素技术（labeled avidin-biotin technique，BA或LAB技术） 用亲和素分子直接与酶分子结合，形成酶－亲和素复合物，再与生物素标记的二抗结合，其敏感性较ABC法又有数倍提高。如用链霉亲和素（streptavidin, SA）代替亲和素，又衍生出LsAB法，该法避免了与切片中内源性生物素结合，特异性更高。 EnVision法 利用线状葡聚糖分子与大量酶结合，再将葡聚糖－酶复合物(EnVision复合物)连接到二抗上，形成酶－葡聚糖－二抗复合物，复合物中酶分子绝对数量远高于其他复合物（可达150个）；同时存在多个第二抗体（15个），增加了该复合物与特异性抗体的结合机会，具高度放大作用。 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 催化放大系统（catalyzed signal amplication, CSA法） 原理是增加了生物素化的酪胺基团分子，通过HRP的催化作用，使酪胺基团分子与抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点，使大量生物素沉积在信号位点上，当再次滴加链霉亲和素－HRP复合物时，原始信号得到几何级放大。 常用IHC方法比较 优点 缺点 适用范围 直接法 操作简单，特异性高 敏感性低，抗体需单独标记 检测肾等活检标本免疫球蛋白、补体等；流式细胞术测细胞表面抗原 间接法 敏感性较高，不必标记每种一抗 特异性较低 检测血清中抗体 酶桥法 敏感性高 过氧化物酶稀释度难以把握；背景较高 其衍生的PAP法和APAAP法应用广泛 ABC法 敏感性高，背景干净 易受内源性生物素干扰 应用最为广泛 EnVision法 敏感性和特异性显著高于其他方法，更省时简便 EnVision复合物分子大，定位核内抗原较差 应用广泛 CSA法 敏感性和特异性高，尤其定位核内抗原 严重内源性物质干扰 应用较少 IHC主要方法演进示意图 酶组织化学技术 酶（enzyme）－生物体内催化各种化学反应和新陈代谢的特殊蛋白质 组织细胞内的酶并不直观可见，但酶可催化特定底物产生相应反应产物，通过检测产物即可在酶所在部位获得相应信号。这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应产物信号来显示细胞和组织结构中的各种酶，对其进行定性、定位和定量分析的方法称为酶组织化学技术 1950s广泛应用于病理学，操作复杂，必需新鲜组织以保持酶活性,反应特异性较低，限制了其应用 酶本身为蛋白质，具有抗原性，可用IHC检测 肌肉组织染色 A.V.G法、Mallory三色染色法、Gomori多色染色法、Gomori氏改良多色染色法、铁苏木素法、偶氮桃红染色法、横纹肌的组织块染色法、苏木素碱性品红苦味酸法、酸性复红光绿染色法、酸性复红染色法、CV-AF染色法和变色酸2R亮绿染色法等 未分化间叶性肿瘤，如横纹肌肉瘤的来源确定 炎症渗出纤维素、弥散性血管内凝血的纤维素染色 神经胶质瘤研究 脂类染色 中性脂肪（甘油三酯