重组DNA技术基础.pptxVIP

;;第二章 重组ＤＮＡ技术根底;DNA组成与结构;〔一〕核酸的分类 ;１.戊 糖;2. 碱 基;核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR;核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP ;5′端;二、核酸的一级结构;A ; DNA的空间结构 ;一、DNA的二级结构 　　　　　〔一〕双螺旋结构;DNA双螺旋结构模型要点 〔Watson, Crick, 1953〕;碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T; G?C〕 。;碱基互补配对 ;稳定因素： 1.氢键维持横向稳定性， 2.碱基堆积力维持纵向稳定性。 3.介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基???间的静电斥力 ;〔二〕与DNA碱基顺序相关的特殊结构 ;镜像重复序列 ;tsDNA是在DNA双螺旋结构的根底上形成的，三条链均为同型嘌呤〔homopurine，Hpu〕或同型嘧啶〔homopyrimidine，Hpy〕，即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。;Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中稳定，较多见 ;(四) 酶活性DNA;;二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装;意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。 ;〔二〕原核生物DNA的高级结构;〔三〕DNA在真核生物细胞核内的组装;;RNA的结构;RNA的种类、分布、功能;mRNA rRNA tRNA;一 、mRNA的结构与功能;* 真核细胞mRNA结构特点;帽子结构;促进mRNA由胞核向胞质的转位 维持mRNA的稳定性 翻译起始的调控 ;* mRNA的功能 把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。;* tRNA的一级结构特点 含 10~20% 稀有碱基，如 DHU 3′末端为 — CCA-OH 5′末端大多数为G 具有 T?C ;* tRNA的二级结构 ——三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TΨC环;;* rRNA的结构; rRNA的种类 ;核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid;1. 核酸的溶解度 核酸是极性分子，微溶于水，不溶于乙醇或异丙醇。 DNA+蛋白质→脱氧核糖核蛋白〔DNP〕： 在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。 RNA+蛋白质→核糖核蛋白〔RNP〕： 在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。; 核酸属于两性电解质，但因为磷酸的酸性较强，因此总体呈现较强的酸性。具有较低的等电点。当溶液的pH?4时，呈多负离子状态，容易与金属离子结合形成盐。;3. 核酸的高分子性质 粘度： DNARNA dsDNA ssDNA 4. 核酸的紫外吸收(OD260) 单核苷酸 ssDNA(或RNA) dsDNA ;;脱氨：C→U;聚合 紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体 ;二、DNA的变性(denaturation);;例：变性引起紫外吸收值的改变;热变性; Tm：DNA变性时紫外光吸收值到达最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。;影响Tm的因素： 1. G+C含量: G+C越高，Tm 越高 2. DNA样品均一性： 均一的DNA样品，Tm范围较狭窄。 3.核酸的种类： 双链RNA ＞RNA-DNA杂交链＞ DNA双链 4.溶液的离子强度 ： 离子强度高，Tm值高 。;三、DNA的复性与分子杂交 ;不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。;核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的根底 ; 核 酸 酶 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶;核酸酶的分类 依据底物不同分类 DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解DNA。 RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。 依据切割部位不同 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。 核酸外切酶：5′→3′或3′→5′核酸外切酶。;参与DNA的合成与修复、RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责去除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以去除侵入细