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核酸分子杂交(molecular hybridization)Tian PingfangCollege of Life Sciences and Technology, Beijing University of Chemical Technology内容概要核酸分子杂交概念核酸分子杂交原理核酸探针核酸分子杂交信号检测核酸分子杂交技术 一、核酸分子杂交概念 用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补发生结合，再经显影或显色方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。 待测核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。 核酸分子杂交（molecular hybridization)特点：灵敏度高（1pg互补序列）速度快（24h）简单易行应用：基因克隆的筛选酶切图谱制作基因组中特定基因序列的定量和定性检测基因突变分析疾病的诊断、微生物病原体检测核酸分子杂交的分类 核酸分子杂交 ↓ 固相杂交 液相杂交印迹杂交 原位杂交 分子杂交的步骤待检DNA或RNA的提取限制性内切酶片段化电泳，转膜，烤膜预杂交加入探针杂交洗膜放射自显影二、核酸分子杂交的原理1、变性：探针和靶核酸都需解链 在某些理化因素作用下，核酸双链碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。3’5’3’5’变性5’3’3’5’两条链解开 A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。 Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。2、复性在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合形成双链的过程称为复性。热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。5’3’3’5’复性探针复性过程： 第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。影响复性的因素单链核酸的起始浓度：起始总浓度可直接影响单链分子的碰撞几率，浓度越高，复性越快。核酸链长度：分子越长，扩散越慢，配对难度越大，复性越慢。核酸分子的复杂性：即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。温度：温度高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度应比Tm低25℃。离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中的未知核酸序列。3、杂交影响核酸分子杂交的因素：探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会自我复性而影响杂交,浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。4、预杂交 为了减少探针与非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。预杂交常用的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，