HPLC分析方法的建立与开发.ppt

梯度平衡时间的影响（二） 平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟 ＆ 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足 ＆ 8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足 第八十八页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 梯度陡时, 使用短色谱柱(降低 Vm)常常能改善分离度 4.6 x 50 mm 1. GLY-TYR 2. VAL-TYR-VAL 3. [GLU]-? 蛋白质 AMYLOID FRAGM 1-16 4. [TYR8 ] 血管舒缓激肽 5. MET-ENK 6. 亮氨酸脑菲肽 7. 血管紧张肽 II 8. KINETENSIN 9. 核糖核酸酶 10. INS (EQUINE) 4.6 x 150 mm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min. k* = 2.5 k* = 2.6 k* = 4.5 k* = 5.9 0 16 12 8 4 C8, 3.5 μm 梯度: 2-75% B in 30 min. 流动相: A= 5:95, ACN : H2O 0.1% TFA B= 95:5, ACN : H2O 0.085% TFA 流速: 1 mL / min. 进样: 10 μL,每种组分2.6 μg 温度: 35°C UV: 215 nm 第八十九页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 仪器对梯度性能的影响 死体积 = 从梯度形成到柱头的体积 提高起始浓度将缩短分离时间, 但由于死体积和形成梯度前的等度步骤，将使分离更依赖于仪器—泵的滞后体积越小越好. 死体积 第九十页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 定性及定量方法 第九十一页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 6、 对等度方法，可以改变ACN%来改善峰间距和分离度 ★若有必要， ACN改为MeOH，并根据峰间距和分离度优化MeOH% ★可以进一步混合ACN和MeOH成为三元溶剂系统，并优化 7、若6方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 第五十六页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 8、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度 ★结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型 ★分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件 9、对梯度方法，改变初始和最后的B%、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间 10、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间 第五十七页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 等度分离方法 第五十八页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 色谱柱：C18，4.6mm×15cm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 （或走梯度） 流速：1ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 第五十九页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 改变容量因子 K (改变比例) ① 对羟基苯甲酸甲酯 ② 对羟基苯甲酸丙酯 ③ 对羟基苯甲酸丁酯 通过改变流动相比例改变选择性 第六十页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 改变选择性∶α 通过改变流动相组成改变选择性 同样强度的不同溶剂 第六十一页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 固定相优化：改变色谱柱 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 4 5 6 7 8 9 10 3 C-18 C-8 Optimization 第六十二页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 10种巴比妥药物的分离（等梯度） 保留时间 (min) 3.14 相对吸光度 4.55 5.74 6.44 7.11 7.74 10.76 11.79 12.63 1 巴比妥 2 阿洛巴比妥 3 阿普比妥 4 苯巴比妥 5 异丁比妥 6 环戊巴比妥 7 布他比妥 8 海索比妥 9 异戊巴比妥 10 甲苯比妥 25% 乙腈 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3 13 第六十三页，编辑于星期一：十八点 五十五分。 优化流动相 - 困难的分离 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 0 20 10 40 30 50 60 70 80 90 100 乙腈/水 甲醇/ 水 四氢呋喃/水 甲醇 1 4 6 7 2 5 3 四氢 呋喃 乙腈