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E-NH2+CH3-C-CH2COOH CH3-C-CH2-COOH CH3-CH-CH2-COOH 此复合物降解，分析酶被底物标记的片段，发现此片段为：Glu-Gly-Thy-Tys-pro-Asn-met-val-底物结合酶的Lys上。 ‖ O ‖ N-E ︱ NH-E NaBH4 酶第二章酶作用基本原理第二节 （1）竞争性抑制剂动力学研究，探测酶催化位点。 竞争性抑制剂与底物具有相似的结构，并且与底物结合在酶的同一位点。标记抑制剂，酶也被抑制剂标记了，后水解酶蛋白，就可发现酶的催化位点。 不可逆抑制剂的研究常有下面三种： 3、抑制剂动力学研究 酶第二章酶作用基本原理第二节 （2）假底物 这类物质与底物有相似的结构，并能与酶的催化基团形成稳定的共价结构，从而不可逆地抑制酶的催化，这些抑制剂称为酶的假底物，如二异丙基氮磷酸（DFP）是某些蛋白酶和脂酶的底物： 酶第二章酶作用基本原理第二节 E-OH+ CH3 CH3 CH-O CH-O CH3 CH3 P ‖ O F [E-OH· CH3 CH3 CH3 CH3 CH-O CH-O ‖ O P] F CH3 CH3 CH3 CH3 CH-O CH-O ‖ P O OE 抑 制 反 应 酶第二章酶作用基本原理第二节 RO-C E-OH+ ‖ R’ O [E-OH· RO-C ‖ O R’] ROH EO -C-R’ ‖ O H2O E-OH+ R’ ‖ C-OH O 底物反应 酶第二章酶作用基本原理第二节 这种抑制标记了酶活性中心Ser，通常ser等的伯醇基相当稳定，不与DFP发生反应，但它一旦参与酶活性中心，由于特定的构象形成，变得非常活跃，表现出超反应性，如胰凝乳蛋白酶分子中含28个Ser，但仅ser195被修饰后，酶失去活性，另外与DFP相似的对硝基苯乙酸也作用于此酶，并标记ser195。 酶第二章酶作用基本原理第二节 （3）类底物 这类底物即具有符合酶专一性的基团，又有与酶起反应基团，但是酶的不可逆抑制剂，如甲苯磺酰phe氯甲酮（TPCK）： 酶第二章酶作用基本原理第二节 TPCK是胰凝乳蛋白酶的抑制剂，即具有符合酶专一性的基团(phe），又有和酶起反应的基团，故叫类底物，但是酶的不可逆抑制剂。它在中性条件下和酶安1：1克分子比例反应，亲和标记酶活性中心His，酶失活，而且酶不再与DFP反应，反之失活的酶也不能与TPCK反应，而且可逆抑制剂会减轻这种失活。说明His57、Ser195共为酶的活性中心，对于胰蛋白酶、凝血酶、血纤蛋白酶、激肽释放酶、木瓜蛋白酶、无花果酶等不能用TPCK： 酶第二章酶作用基本原理第二节 酶第二章酶作用基本原理第二节 （4）自杀性底物suiside substrate 这类物质具有与天然底物类似结构，或本身就是酶的底物，但含有一潜伏的基团，这个基团被酶催化的同时，暴露而活化并与酶的催化基团反应，抑制酶作用而标记催化基团（Kcat）： E+Si Esi Ei （Si为自杀性底物） 酶第二章酶作用基本原理第二节 如某些以His和Ser为活性中心的蛋白酶和酯酶，它们能水解卤代内脂类（如3，4-二氢-6-氯甲基香豆素），使之开怀，开环后的酰基能迅速和酶活性中心Ser的-OH反应，同时其卤代基和His的咪唑基超反应，从而导致Kcat标记和抑制： 酶第二章酶作用基本原理第二节 酶的Kcat标记(抑制) 酶第二章酶作用基本原理第二节 由于pH的变化影响酶分子中氨基的解离状况,从而影响反应速度.因此通过logVm-pH作图,可以探测酶的活性中心包括哪些氨基酸残基.如下图所示： 4、改变pH条件动力学研究 酶第二章酶作用基本原理第二节 过氧化物酶催化反应： H2O2+AH2 A+2H2O AH2为供氢体， 此酶为一铁卟啉蛋白，在波长645、583、548、498nm处有四条吸收光带。 当加入H2O2，在波长561、530.5nm下两条新吸收带。 说明酶与底物发生了某种作用。 过氧化物酶+ H2O2 [过氧化物酶. H2O2] 过氧化物酶 酶第二章酶作用基本原理第二节 此时，若加入AH2 ，反应进一步发生： [过氧化物酶. H2O2]+ AH2 过氧化物酶+A+2H2O 新的两条带消失，原来的四条带恢复， 说明ES-复合物已分解出产物。 酶第二章酶作用基本原理第二节