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miRNA 芯片 miRNA 芯片使用指南 一、 miRNA 芯片基本常识 1. miRNA 定义 生物体内由 genome DNA 编码的长度约 22 nt 的非编码的调控 RNA 家族。有以下 3 个生物学特点： z 高度的保守性 z 表达的时空特异性，与其功能相关 z 独特的成熟过程 2. 发挥功能的方式 z RNA 降解：与靶 RNA 互补 ; z 翻译抑制：与靶 RNA 的 3-UTR 互补。 3. 应用（已有的文献报道，还有很多应用在使用中） z 线虫的发育过程 z 干细胞的分化 z 植物的细胞生长受到抑制（转入 miRNA 后） z 药物治疗的靶标 z 病毒感染机制等等 4. 研究 miRNA 常用方法 z 克隆、 RNA 保护实验 z PCR 方法扩增：通用引物扩增 5. miRNA 芯片实验难点 z 本身 22 nt 很短，探针设计困难，特异性差。 z 细胞本身表达的 miRNA 量少， 10 μg total RNA 只含有几 ng miRNA ，标记 很困难。 6. 标记方法 z 直接标记： kit z 扩增标记： miRNA 克隆：电泳分离出 miRNA 分子，加上接头，然后用通用 引物扩出。用 PCR 产物进行杂交。 7. 我公司哺乳动物 miRNA 芯片基本参数： z 探针： 435 个，人的 435 个，小鼠的 261 个。针对成熟 RNA 设计的互补序 列。样品处理时会只留下 30bp 的 RNA , 这样区分前体 RNA 和成熟 RNA 。 z 标记方法： 直接标记。 Ambion 公司的 kit 。POLY(A) 聚合酶在 3 端聚合上 -NH 2 修饰的碱基，再用特异的结合 -NH 2 的荧光染料标记，即后标的方法。 z 技术流程：样品：组织或细胞样品或 total RNA （无降解） z RNA 量： 50 μg, 100 μg ( 荧光交换 ) z 分离 miRNA ：Ambion 公司的 kit （柱子），截流 120 bp 以下的 RNA 分子 （原 则上是 200 bp ） z 杂交： RNA 与 Oligo 探针杂交。 z 成本： Ambion 公司的 kit 较贵，小分子的纯化较困难。 博奥生物产品手册 2006Q1 版 1 内部资料 请勿外传 miRNA 芯片 二、 miRNA 芯片实验基本流程 1. 组织块和细胞 RNA 的提取 Trizol 一步法提取组织块或细胞中的总 RNA ，通过异丙醇沉淀法浓缩 RNA ，用分 光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检总 RNA 的质量。 2. miRNA 的分离 取 50-100.0 μg total RNA 用 Ambions miRNA Isolation Kit (Cat# 1560) 或者聚乙二 醇的方法（ FEBS Letters, 2005, 579