elisa酶联免疫吸附实验报告材料.pdf

实用标准 elisa 酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定 （enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA）是在免疫酶技术 （immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 ,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体 上称为包被， 加待测抗体 （抗原）, 再加相应酶标记抗体 （抗原）, 生成抗原 （抗体）－－待测抗体 （抗原） －－酶标记抗体的复合物， 再与该酶的底物反应生成有色产物。 借助分光光度计的光吸收计算抗体 （抗原） 的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶， β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸 酐酶，乙酰胆碱酯酶， 6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。 常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶， 碱性磷酸酯酶等， 其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化 作用使颜色加深，无法准确地定量。 文档大全 实用标准 辣根过氧化物酶（ HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（ protonhemin ）区作辅基。酶的浓 度和纯度常以辅基的含量表示。 氯化血红素辅基的最大吸收峰是 403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm， 所以酶的浓度和纯度计算式是（已知 HRP的 A （1cm403nm 1%）＝ 25 ，式中 1 ％指 HRP百分浓度为 100ml 含 酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是 HRP的 A （1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（ RZ） =A403nm/A275nm纯度 RZ （Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP的 RZ 值在 3.0 左 右，最高可达 3.4 。用于 ELISA 检测的 HRP的 RZ值要求在 3.0 以上。 ELISA 的基本原理有三条： （1 ）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面， 可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附， 并保持其免疫学活性； （2 ）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3 ）酶结合物与相应抗原或抗体结合后， 可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且 颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的， 因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非 传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为 文档大全 实用标准 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而 且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 , 因此， 也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定 抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医 学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1 、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2 、研究抗酶 抗体的合成。 3 、显现微量的免疫沉淀反应。 4 、定量检测体液中抗原或抗体成份。 基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法 : 1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～ 10 μg ／ml