免疫组化原理、步骤及要注意的事项.docVIP

免疫组化 一，免疫组织化学简介 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原 位通 过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量 测定的一 项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来， 借助显微镜 （包括荧光显微镜、电子显微镜 ）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞 水平检测各 种抗原物质 （如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等 ）。 二，免疫组化技术的基本原理 免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体 的研 究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的 关系，确 认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上， 制成酶标抗体，再借酶对底物 的 特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显 微镜或 电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可 将其分为直 接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记 的抗体可以是 用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体， 最好是特异性 强的高效价的单 克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶 标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化 间接染色法。 三，免疫组化步骤 1, 切片，烤片 60C, 1h; 2, 脱蜡及复水 二甲苯 10min, 100% 乙醇 5min, 95% 乙醇 5min, 90% 乙醇 5min, 85% 乙醇 5min, 80%乙醇 5min, 75% 乙醇 5min, 60% 乙醇 5min, 50% 乙醇 5min, 30% 乙醇 5min, 自来水 1min, 双氧水 1mi n ； 3, 1 份 30% H2O2加 10 份蒸馏水，室温 10min, 蒸馏水洗 3 次，每次 3min； 4, 微波修复 将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液，微波中最大火力 (98 E-100 C ) 加热至沸腾， 冷却 ( 约 5-10min), 反复两次； 5, 将切片自然冷却至室温， PBS洗涤 3 次，每次 5min； 6, 封闭， 5%BSA,室温 20min, 甩去多余液体 ; 7, 滴加一抗， 37C, 1h, 或者 4C过夜 ; 8, PBS洗涤 3 次，每次 3min； 9, 滴加二抗， 37°C, 15-30mi n； 10, PBS洗涤 3 次，每次 3min； 11, 滴加 SABC, 37 C , 30min ； 12, PBS洗涤 3 次，每次 5min； 13, 1ml 蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀 ; 14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约 5min ）； 15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水 ; 16, 苏木素复染 2min, 自来水冲洗 ; 17, 脱水 30%乙醇 3min, 50% 乙醇 3min, 70% 乙醇 3min, 80%乙醇 3min, 90% 乙醇 3min, 95%乙醇 3min, 100% 乙醇 3min, 二甲苯 20min ； 18, 树胶封片，镜检。 四，免疫组化常见问题分析 1, 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象 1） 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度； 2） 用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做； 3） 有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS不要直接冲到组织 上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织； 4） 用高温修复时，温度骤冷也可能引起。 2, 边缘效应 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组 织下面试剂洗尽所致 ?解决办法：制备优质的胶片（ APES或多聚赖氨酸），切出 尽量薄的组织切片，不厚于 4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死 较多的组织； 2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心 组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘 2mm。用 组 化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘 3-4mm。 3, 产生组织切片非特异性染色 1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗 / 二 抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条； 2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看； 3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组 织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色； 4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时 间和适当增加浓度来加