新冠病毒的实验室检测指南.pdf

新冠病毒的实验室检测指南 （一）检测人员要求。 实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相 关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。 检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检 测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。 （二）实验室检测。 1.实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒核酸。 （1）核酸检测实验室。新冠核酸检测实验室按功能区 布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开 展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存 和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据所采用仪 器的实际情况，标本制备区、扩增和产物分析区可进行合并。 集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动（注 意风向，压力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原则。 各区的功能如下： ①试剂储存和准备区：用于分装、储存试剂、制备扩增 反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或 冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防 止污染，该区宜保持正压状态。 ②标本制备区：标本转运桶的开启、标本灭活（必要时）、 核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰 柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实 际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、 — 104— 分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压 状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立 的生物安全二级 （BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转 运至该区加至扩增反应液中。 ③核酸扩增和产物分析区：进行核酸扩增反应和产物分 析。该区应配备实时荧光定量PCR仪。为防止扩增产物污染 环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。 （2）新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测。 实验室应当制定标准操作程序 （SOP），并严格按照SOP 进行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清 点核对，并依据SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、 核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检 的流程。 ①试剂准备。应当选择国家药品监督管理部门批准的试 剂，建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，建议根据 核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不 建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。 ②标本处理。使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需进 行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液 的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸 提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病 毒。不推荐采用56℃孵育30分钟的处理方式灭活病毒，该条 件不能保障充分灭活病毒。 — 105— 污水样本处理可参考 《农贸 （集贸）市场新型冠状病毒 环境监测技术规范》（WS/T776—2021）推荐的方法。 ③核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打 开标本采集管加样。或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本 与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成 后立即封盖。取适量核酸加至PCR 扩增反应体系中。 ④核酸扩增。将扩增体系放入荧光定量PCR仪，按照试 剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应 管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按 一般医疗废物转移出实验室处理。 本指南中的核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中 开放读码框1ab （open reading frame 1ab，ORF1ab）和核 壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。 靶标一 （ORF1ab）: 正向引物 （F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物 （R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA 荧光探针 （P）： 5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3 靶标二 （N）: 正向引物 （F）：GGGGAACTTCTCCTGCTA