现代分子诊断技术.ppt

利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类;分离杂交探针的方法： 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 限制性内切酶进行酶解 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选;核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测;4、非同位素标记探针;非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 检测发光和颜色变化可在几小时内完成;;荧光标记的引物直接进行PCR检测;分子夹心探针检测;TaqMan探针技术;3′;疟疾的分子诊断：;DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 具体的分离过程： 构建一个疟原虫的核基因文库 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 选出那些杂交信号最强的克隆 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性 ;锥虫的检测;PCR检测 针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带 ;二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术;DNA杂交;PCR检测;;PCR技术也会产生假阳性 新扩增的目的DNA特异性不强 退火温度过低 模板中杂质的污染 假阴性 存在Taq酶的抑制剂 模板量过少 模板DNA纯度不够 ;原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测 不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位;原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态;噬菌体介导细菌检测;;第三节 DNA指纹;每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA” “小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA “中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹” 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99．99％的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”;所罗门的审判：;滴骨验亲法：;合血法：;方法：;30