基于异类分析算法的结肠癌新亚型发现与治疗靶点的探索及其机制研究.docVIP

PAGE PAGE 62 基于异类分析算法的结肠癌新亚型发现与治疗靶点的探索及其机制研究 摘要 背景：结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是一种常见的消化系统肿瘤之一，其全球范围内发病率和死亡率仅次于胃癌以及食道癌，高居胃肠道恶性肿瘤第三位，严重威胁着人类的健康[1-3]。尽管近年来对结肠癌发生发展机制以及靶向治疗方面取得一定进展，患者预后得到一定的改善，然而死亡率依旧高居不下[4-6]。结肠癌是一种多基因突变的癌症，伴随多种原癌基因的激活以及抑癌基因的失活，其发生发展过程的分子机制十分复杂，目前尚未研究清楚，因此，深入研究和探讨结肠癌发生发展过程中的分子机制，对结肠癌的诊断和治疗具有重要的意义[7, 8]。 近年来，Oncomine和TCGA等一系列整合了大量肿瘤临床样本基因芯片数据库的成立和利用，对肿瘤发生发展的分子机制的研究，潜在靶点、肿瘤标志物的筛选，靶向性药物的研发都起着重要的作用。Oncomine 是目前世界上最大的癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，旨在挖掘癌症基因信息，该数据库已经收集了729个基因表达数据集，90000多个癌症组织和正常组织的样本数据，可用于比较癌症和正常组织的差异表达分析，也可以用于探索各种癌症亚型以及基于临床和病理学的比较分析，同时还可以进行药物敏感性、突变或甲基化引起的表达变化等方面的分析，进行一个或多个基因的查询，结果可视化。目前，大数据时代中肿瘤的研究得到进一步突破，包括肿瘤标志物和患者预后评价指标等在内的研究有了更可靠的论据[9-11]。因此，采用异类分析算法对结肠癌的新亚型进行探索分类，并筛选和评价靶向性药物的疗效，在寻找更优的治疗方式上具有很大的应用价值。 目的和意义： 本研究旨在通过对肿瘤数据库进行异质性基因分析（Outlier 分析），筛选差异表达的基因，鉴定新的亚型和相应的靶标基因，进而针对不同亚型的结肠癌筛选对应的抗肿瘤药物，建立系统的结肠癌亚型分类以及诊断治疗预后的潜在指标数据，以期为结直肠癌的治疗提供新的分子靶标和药物方案，为临床攻克结直肠癌提供理论基础和支持。 方法： 一、基于异类分析算法发现结肠癌新亚型和治疗靶点 1、采用异类（Outlier）分析，对Oncomine中结肠癌样本的基因表达数据进行分析，筛选异质性表达基因。 2、采用Meta分析，合并各个数据集的分析结果，筛选出在各个数据集中均有异质性表达的基因，并锁定靶向基因。 3、利用TCGA数据结肠癌样本的临床信息，分析靶基因在结肠癌病人中的表达情况。 4、采用Real time PCR和western blot的方法检测靶基因在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞系中的表达水平。 二、结肠癌治疗靶基因的功能及机制探索 1、利用生物信息学软件设计并合成靶基因的siRNA。 2、将合成的靶基因siRNA转染结肠癌细胞后，MTT法检测结肠癌细胞的增殖活性。 3、将合成的靶基因siRNA转染结肠癌细胞后，Transwell细胞迁移和侵袭实验检测结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。 4、将合成的靶基因siRNA转染结肠癌细胞后，利用流式细胞术检测靶基因对结肠癌细胞凋亡的影响。 5、通过裸鼠皮下成瘤模型实验，将敲减靶基因的结肠癌细胞接种于裸鼠皮下，研究靶基因对小鼠肿瘤生长的影响。 6、采用western blot的方法检测敲减靶基因对结肠癌细胞增殖相关蛋白cyclin D1、凋亡相关蛋白caspase9以及迁移和侵袭相关蛋白E-cadherin的影响。 三、结肠癌治疗靶向药物的筛选及功能验证 1、基于发现的靶向基因通过FAD数据库筛选靶向性药物。 2、靶向药物处理结肠癌细胞后，MTT法检测结肠癌细胞的增殖活性。 3、靶向药物处理结肠癌细胞后， Transwell细胞迁移和侵袭实验检测结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。 4、靶向药物处理结肠癌细胞后，利用流式细胞术检测靶基因对结肠癌细胞凋亡的影响。 5、通过裸鼠皮下成瘤模型实验，将靶向药物处理的结肠癌细胞接种于裸鼠皮下，研究药物对小鼠肿瘤生长的影响。 结果： 一、基于异类分析算法筛选结肠癌新亚型和治疗靶点 1、通过异类分析算法发现，CD44和Twist1可以作为鉴定结肠癌新亚型的生物学标志物，可作为治疗结肠癌的潜在靶基因。 2、通过对结肠癌临床样本的分析发现，CD44和Twist1在结肠癌病人中呈显著高表达。 3、Real time PCR和western blot的检测发现CD44和Twist1的mRNA和蛋白水平均在结肠癌细胞系中较正常结肠上皮细胞系中呈显著高表达。 二、结肠癌治疗靶基因的功能及机制探索 1、利用生物信息学软件成功设计并合成CD44和Twist1的siRNA。 2、MTT法检测发现si-CD44和si-Twist1后结肠癌细胞HT29的增殖活性明