T细胞亚群分离 .docxVIP

PAGE PAGE 1 T细胞亚群分离 （一）抗体／补体介导的特异性细胞毒作用分别T细胞亚群（T cell subset) 【原理】人T淋巴细胞按其表面标记分为CD4+T和CD8+T细胞两类，其细胞膜上分离有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参加下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分别出另一种细胞亚群。【材料】1．聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）；2. Hanks液（内含5％和1.0g/L）；3．新奇兔血清，；4．抗CD4和抗CD8单克隆抗体。【办法】1．常规分别人外周血单个核细胞，配成1x107/ml细胞悬液。2．取1 ml细胞悬液加入适量的抗CD4单克隆抗体，37℃孵育30分钟。3．用Hanks液洗2次，1000r/min,10分钟，去除游离抗体。4．加入新奇的适量的兔血清，37℃ 1小时。5．离心1000r/min,10分钟，弃上清液。6．用Hanks液洗4次，获得CD8+T细胞，储存于4℃备用，并举行纯度和活力检测。假如用抗CD8单抗代替CD4单抗，可获得CD4+细胞。【结果】用该法分别的T细胞亚群活力可达到95％以上，间接或挺直免疫荧光技术检测分别T细胞亚群的纯度。【注重事项】1．试验应在4℃下举行，以保持细胞活力。2．每次制备的鼠抗人T细胞单抗和兔新奇血清效价并不全都，所以每次制备后均需经过预实验确定抗体和补体的稀释倍数。（二）盘选（panning）分别法分别T细胞亚群【原理】各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于聚苯乙烯平板上，然后加入细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中猎取。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分别得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分别CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分别B细胞。同样，用活化的C3包被，可分别出有C3受体的细胞。【材料】1．聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。2．抗CD4和抗CD8单克隆抗体；羊抗鼠IgG抗体。3．缓冲液Hanks液（含5％小牛血清、不含Ca2+、Mg2+);pH 9.0,0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液；pH 7.5,0.15mo1/L PBS（含10％）;pH 7.2,0.15mol/L PBS。4.盐酸利多卡因（20mg/ml)。【办法】1．羊抗鼠IgG抗体包被平皿用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG（浓度为10ug/ml)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。2. CD8+细胞的分别(1)取肝素抗凝外周血，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液法分别单个核细胞，E玫瑰花环技术分别T细胞，用Hanks液将T细胞沉淀配成（3～4)x106/ml;(2)取T细胞悬液与适量的抗CD4单克隆抗体反应，4℃反应30分钟；(3）用Hanks液洗细胞2次，每次1000r/min离心10分钟，去除未结合的单克隆抗体；(4)取3ml细胞悬液加入到羊抗鼠IgG抗体包被的培养皿中，室温反应1小时。注重间隔10～15分钟轻摇一次；(5）用 5ml Hanks液轻轻洗脱下未黏附细胞，普通4次，收集的细胞（即为CD8+细胞）4℃存放。注重：避开用吸管挺直触动平皿。3. CD4+细胞的分别(1)用Hanks液配制盐酸利多卡因，终于浓度为4mg/ml;(2）加3～4ml利多卡因溶液到洗过的培养皿中，室温下静置10～15分钟，尖吸管吹打细胞，直到黏附的细胞所有剥脱为止；(3)用Hanks液洗平皿，离心细胞，1000r/min,10分钟，细胞沉淀再用Hanks液洗3次，获得CD4+细胞。【结果】将获得的CD4+和CD8+细胞4℃保存备用，用挺直或间接免疫荧光法检测分别的细胞纯度。【注重事项】1．为了把黏附到固体基质上而导致的非特异性结合削减到最小程度，需用无Ca2+,mg2+培养液。2．按照培养皿底的面积适当地调整细胞悬液的体积，且需有足够的单克隆抗体吸附于塑料表面上。