lecture9固定化酶与细胞3节课.pptxVIP

固定化酶和固定化细胞;为什么要固定酶？;主要内容;一、酶的固定化;1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。 1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。 1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。 ; 采用各种方法，将酶固定??水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程称为酶的固定化。 固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 ;固定化酶的优点;固定化时，酶活力有损伤 增加了生产的成本 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应 胞内酶必须经过酶的分离手续 ;酶的分类;3、固定化酶的制备原则;4、酶的固定化方法 Methods of immobilisation;a 吸附法 adsorption b 共价结合法 covalent binding c 网格法 entrapment d 微囊法 membrane confinement ;（一）非共价结合法;酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法，是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 优点：对酶影响小。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。 缺点：作用力弱，易脱落。 ; 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体。 阴离子交换剂：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等。 阳离子交换剂：如羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、Dowex—50等。 例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。 ;共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。 可以将载体有关基团活化，也可在载体上接一个双功能基团，然后将酶偶联上去。 结合牢固，但反应条件苛刻，操作复杂，对酶影响大。 ;;可与载体共价结合的酶的功能团—?或?氨基（-NH2）、?、?或?-羧基(-OH)、巯基(-SH)、羟基(-COOH)、咪唑基、酚基等。—参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则往往造成固定后的酶活性完全丧失。;羟基聚合物纤维素、葡聚糖、琼脂糖及胶原等可用溴化氰法、烷基化法等。;溴化氰法;烷基化法;2.交联法 就是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。 交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但固定化酶比活的提高。 ;;（三）热处理法;将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型 将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型 ;包埋法特点;常用的载体材料1. 网格型—聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物,常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方法—淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物,在酶或微生物存在下凝胶化;2. 微囊型—通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。—制备微囊型固定化酶方法。 （1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）二级乳化法;界面沉淀法—利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。特点—条件温和，酶失活少，—但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。;(五）其他方法-脂质体包埋法 由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。 ; 固定化酶(细胞）应用实例;各种固定化酶方法的优缺点比较;没有一个方法是十全十美的，几种方法各有利弊;5、固定化酶的性质;固定化酶活力 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高。 原因： 酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化。 固定化后，酶分子空间自由度受限制（空间位阻），直接影响到活性中心对底物的定位作用。 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻。 包埋时酶