乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选.docVIP

乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选 1 1材料和方法 2 文2：ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定 6 1 材料与方法 7 2 结 果 8 3 讨 论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选 文1：乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选 0引言 在整体或细胞水平转移外源基因进行遗传学改变、修饰是目前基因 治疗 的重要方式. 基于此理的RNA干扰(RNA interference, RNAi)通过采用一小段RNA(small interference RNA, siRNA)特异性地关闭特定基因使之“沉默”,失去其功能以达到相应治疗作用成为基因治疗新的靶点［1］. 但低效率的基因转移过程通常是基因治疗的瓶颈, 通过构建多基因共表达载体成为解决这一问题的策略之一. 乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）是近几年逐步明确的参与肿瘤转移过程的葡萄糖醛酸酯酶，可降解细胞外基质中的乙酰肝素蛋白聚糖，破坏基质 网络 状结构，使膜的功能降低，更易于肿瘤组织扩散［2 ］. 为此，我们通过自行设计并构建包含两段HpashRNA的、携带有各自的Ｕ6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）基因和Neo基因的pGenesil1HpashRNA载体,利用质脂体介导的方法转染卵巢癌细胞株SKOV3，分析RNAi对Hpa基因表达抑制作用，探讨多基因共表达的增效可能. 1材料和方法 材料 线性化的质粒载体pGenesil1（武汉晶赛生物公司）；工具酶（日本TaKaRa公司）；质粒提取盒（中鼎公司）；METAFECTENE转染试剂（德国Biontex公司）；dsDNA片段（武汉晶赛生物工程公司化学合成）；山羊抗人Hpa多克隆抗体（Santa Cruz公司）；SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（棕色）（武汉博士德公司） 方法 发卡样Hpa基因（HpashRNA）设计根据GenBank提供的Hpa基因cDNA序列,通过基因Blast验证,挑选6条长各为21个碱基的特异性寡核苷酸序列5′ GTACTTGCGGTTACCCTAT ３′; 5′ GCTTCGTACCTTGGCCAGA ３′; 5′ TTGCTACTCCGAGAACACT ３′; 5′ TGGGTCGCAGTTAGGAGAA ３′; 5′ GGAAGCTTCGAGTATACCT ３′; 5′ GCTTCGAGTATACCTTCAT ３′. 分别在5′和3′端引入BamH I和Hind III酶切位点,按如下结构BamHI+See+Loop+Antisee+终止信号+Sac I/EcoR Iac Ial Ial I/Xba I+Hind III化学合成有发卡样结构的shRNA寡核苷酸单链,同时合成互补链. 的构建用50 μL annealing buffer溶解上述单链目的基因片段. 各取2 μL单链+16 μL annealing buffer，94℃退火 自然 冷却至室温. 用双链退火连接后再磷酸化的退火片段分别与线性化Pgenesil1载体连接，22℃水浴反应过夜,构建的阳性克隆命名为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3） 扩增及纯化各取5 μL连接产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜. 各挑取3个单克隆菌落接种于3 mL含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜. 收集菌液,小量快速抽提质粒DNA,15 g/L琼脂糖凝胶电泳，部分菌液送上海申友公司测序. 细胞转染及表达鉴定提取3种重组质粒，并进行DNA定量. SKOV3细胞生长到占瓶底约80%～90%时，分为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3）及非特异性shRNA片段对照4组，按照METAFECTENE转染试剂盒操作方法转染，以含800 mg/L G418的RPMI 1640培养液培养4 wk，筛选阳性克隆. 荧光显微镜观察EGFP的表达并照相. 流式细胞仪检测转染效率将1×107/L的培养细胞用 g/L胰酶消化，PBS清洗,上流式细胞仪（美国BO公司，FACSealiber)检测,激发光为488 nm,接收光为530 n