ELISA的原理与应用 .pptxVIP

ELISA的原理与应用;一、免疫检测的基础知识二、ELISA的基本知识三、本次ELISA实验操作解读;1　抗原 　　抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后,可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质,例如完整的病毒粒子、细菌等。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的,称为半抗原。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇,或称为表位。一个抗原分子可带有不同的决定簇,例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。;2　抗体 抗体的结构 　　抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。 五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链和μ(mu)链。 ;　重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异,称为可变区,分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位,只与相应的抗原决定簇匹配,发生特异性结合(见图),是抗体专一性结合 抗原的结构基础。 机体被微生物感染后,先产生IgM抗体,然后产生IgG抗体。经过一段时间,IgM抗体量逐渐减少而消失,而IgG抗体可长期存在,在疾病痊愈后可持续数年之久。;1、1　抗原抗体反应 ;1、1、2　特异性 ;1、1、3　最适比例 ;1、1、4　敏感性;1、2　免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广。 1) 体液中的各种蛋白质,包括含量极少的蛋白质。 2) 激素,包括小分子量的甾体激素等。 3) 抗生素和药物。 4) 病原体抗原,如胶体金测禽流感病毒。 5) 另外,也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。 ;免疫标记技术;免疫酶测定法(Enzyme Immuno Assay,EIA);酶标抗体技术;酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA);1、 ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。 在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直截了当相关,故可依照呈色的深浅进行定性或定量分析。;酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA);3、 ELISA的试剂(A、B、C三部分);ELISA的试剂准备A ;3、1、2 　包被的方式;不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采纳捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体,加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。 优点:试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。抗原用量少,仅为直截了当包被的1/10乃至于/100。;包被用抗原: 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直截了当吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。 ;3、1、4 　包被用抗体;3、1、5 　包被的条件;3、1、6 　封闭;3、4 　洗涤液 　　在板式ELISA中,常用的稀释液为含0、05%吐温20磷酸盐缓冲液。;　ELISA的试剂准备B ;3、2、1 　结合物用的抗原和抗体;;3、2、3 　结合物的制备; 结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,因此制备的酶结合物应予纯化,去