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新一代测序法简介 新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和 DNA 的组成 (定性分析 ) ，也 可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析） ，以及不同类型基因或 DNA 之间的差别所在（交叉对比分析） 。自 2004 年， 454 测序技术发展以来，已经出现的测序产 品超过六种之多。 这些产品的技术特点见下表： 产家名称 产品技术特点 优缺点 化学反应 测序方法 误读率 样品准备 高通量程度 Roche 焦 磷 酸 标 记 的 链 焦 磷 酸 基 1% 较复杂，需 PCR 中等 (454 Life Science) 反应 标记 Illumina （Solexa ） 四色可逆终止码 合成法 1%— 3% 较复杂，需 PCR 中—高 ABI(SOLID) 双色可逆终止码 合成法 1%— 5% 较复杂，需 PCR 中—高 Helicos Bioscience 单色可逆终止码 合成法 2%— 8% 简单，无需 PCR 高—超高 Intelligent Biosystm 四色可逆终止码 合成法 1%— 5% 较复杂，需 PCR 中—高 Pacific Bioscience 四 色 焦 磷 酸 基 标 焦 磷 酸 基 3%— 8% 简单，无需 PCR 高 记 标记 VisiGen 焦 磷 酸 基 标 记 焦 磷 酸 基 3%— 8% 简单，无需 PCR 高 FRET 标记 在这些技术中， 从所分析的样本在测序前是否需要扩增， 大致可以分为两类， 即克隆扩 增型和单分子测序型。 两种类型在测序技术上区别并不大， 但对结果的影响却有不小的差别。 主要体现在两个方面： （1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况， 尤其是在需 要定量分析的情况下。 而克隆扩增型中的 PCR 反应使得样品中 DNA 分子的扩增机会并不完 全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响； （2 ）单分子测序具有通量更高的优势。克隆 扩增使得同一类型的分子数目急剧上升， 在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时， 也 降低了不同类型分子出现的机会。 面重点介绍 Pacific Biosciences 公司推出的 Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing （单分子实时 DNA测序）。 首先，在这一测序技术中有主要有两个关键的技术： 一、荧光标记的脱氧核苷酸避免了碱基的空间位阻效应。 显微镜现在也无法实现实时看 到“单分子”，但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入 DNA 链的时候，它的荧光就同时能在 DNA链上探测到。 当它与 DNA链形成化学键的时候， 它的荧 光基团就被 DNA聚合酶切除， 荧光消失。 这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响 DNA聚合酶的 活性，并且在荧光被切除之后，合成的