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生物技术专业主干课程;第五章 噬菌体载体和柯斯载体; 单链DNA噬菌粒载体;第三节 柯斯质粒载体;1.柯斯质粒的定义及其构建; (2)柯斯质粒载体定义
1978年,J. Collins和B. Hohn,发展出了柯斯质粒载体(cosmid vectors),在一定程度上满足了真核生物基因克隆的要求。
cosmid=cos site-carrying plasmid
粘(黏)粒、柯斯体、粘合体…中文译法不好
*定义:一类由人工构建的带有?DNA的cos序列和大肠杆菌质粒复制子的特殊类型的质粒载体。;(3)柯斯质粒pHC79的构建
从pHC79这个名称起头字母P,也就说明了cosmid的中文名称叫柯斯质粒为好。
pHC79 ?phage中的cos序列及其控制包装作用的序列
pBR322中的完整的复制子:ori
Terr基因
Ampr基因;(4)柯斯质粒的克隆能力及其组成。
柯斯质粒的克隆能力可达45kb
柯斯质粒本身分子量较小,典型的是5kb-7kb的环形DNA分子,它由如下4部分组成:
一个质粒的复制起点;
一个或数个选择记号;
大量的限制酶单一识别位点;
一个cos位点(此系包装的必要条件);;2. 柯斯质粒的特点;(2)具有质粒载体的特点:
;(3)具有高容量的克隆能力
*1. 柯斯质粒只有一个ori、一两个选择记号、大量的限制酶的单一识别位点和一个cos位点。因此它的分子比较小,只有5kb-7kb左右,所以它可以克隆大至45kb的外源DNA片段,其低限值为30kb。
;*2.Cosmid的克隆能力取决于:
①能包装到?phage头部的DNA分子量的大小
②载体本身分子量的大小
;(4)能够与带有同源序列的质粒DNA发生重组作用
*1.共合体的形成
柯斯质粒与带有同源序列的质粒在同一个细胞中共存时,它们之间便可形成共合体(cointegrant)。
若质粒和cosmid各带有一个不同的抗药性记号及相容的复制起点,在转化至另一个菌株细胞之后,能够很容易地选择出含有两个不同选择记号的共合体。
*2.共合体的概念
由一种具有一个转位子的复制子,同另一种不具转位子复制子融合而成的结构。在其两个复制子结合部位,具有一对同向重复排列的转位子拷贝。;3.柯斯质粒载体的改良
(1)将两个cos位点组入到同一个柯斯质粒载体上???以简化在cosmid上的定向克隆。
(2)构建与通用质粒载体无同源性的柯斯质粒载体
在具重组能力的细胞中同时具有这种载体时,它们之间就不会发生重组,但如果它们各带上同源的外源DNA时,两者之间就会发生重组形成共合体。
(3)使cosmid带上由噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子,这些启动子可在体外合成克隆的插入片段之任意一端的特异性RNA探针。;(4)在cosmid中加入选择性记号,以简化鉴定经重组cosmid转染的真核细胞的步骤。
(5)在cosmid中加入真核基因复制起点,以使转染的cosmid能够在哺乳动物细胞中自主复制。
(6)在cosmid中加入原核标记,以促进转染到哺乳动物细胞内的cosmid序列在细菌中获救。
(7)用噬菌体复制起点代替质粒复制起点,有证据表明如此可缓解由携带ColE1起点的重组cosmid所造成的生长速度不同的问题。;4. 柯斯克隆(Cosmid cloning); (2)理论依据
a. 在?phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列,即所谓的粘性末端(cos位点)
b. ?phage的多连体分子是由cos连接而成的。
cos cos cos cos cos cos
;c.末端酶(treminase)或叫Ter体系——即?phage具有一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system).
*此系统能识别两个相距适宜的(38-54Kb)cos位点,并切割之。
*根据上述分析可知?phage DNA包装的两个必要条件是:
cos位点
Ter体系;(3)柯斯质粒包装条件
由于只有在被作用的?DNA分子具有两个cos位点,而且它们之间距离保持在38-54Kb的条件下,Ter体系才能对它发生作用。
据此推断:柯斯质粒是不能作为包装体系的,因为它只有一个cos位点。
因此:柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达38-54K
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