基因工程学第五章34节.pptx

生物技术专业主干课程;第五章 噬菌体载体和柯斯载体; 单链DNA噬菌粒载体;第三节 柯斯质粒载体;1．柯斯质粒的定义及其构建; (2)柯斯质粒载体定义 1978年，J. Collins和B. Hohn，发展出了柯斯质粒载体(cosmid vectors)，在一定程度上满足了真核生物基因克隆的要求。 cosmid=cos site-carrying plasmid 粘（黏）粒、柯斯体、粘合体…中文译法不好 *定义：一类由人工构建的带有?DNA的cos序列和大肠杆菌质粒复制子的特殊类型的质粒载体。;(3)柯斯质粒pHC79的构建 从pHC79这个名称起头字母P，也就说明了cosmid的中文名称叫柯斯质粒为好。 pHC79 ?phage中的cos序列及其控制包装作用的序列 pBR322中的完整的复制子：ori Terr基因 Ampr基因;(4)柯斯质粒的克隆能力及其组成。 柯斯质粒的克隆能力可达45kb 柯斯质粒本身分子量较小，典型的是5kb-7kb的环形DNA分子，它由如下4部分组成： 一个质粒的复制起点； 一个或数个选择记号； 大量的限制酶单一识别位点； 一个cos位点(此系包装的必要条件)；;2. 柯斯质粒的特点;(2)具有质粒载体的特点： ;(3)具有高容量的克隆能力 *1. 柯斯质粒只有一个ori、一两个选择记号、大量的限制酶的单一识别位点和一个cos位点。因此它的分子比较小，只有5kb-7kb左右，所以它可以克隆大至45kb的外源DNA片段，其低限值为30kb。 ;*2.Cosmid的克隆能力取决于： ①能包装到?phage头部的DNA分子量的大小 ②载体本身分子量的大小 ;(4)能够与带有同源序列的质粒DNA发生重组作用 *1.共合体的形成 柯斯质粒与带有同源序列的质粒在同一个细胞中共存时，它们之间便可形成共合体(cointegrant)。 若质粒和cosmid各带有一个不同的抗药性记号及相容的复制起点，在转化至另一个菌株细胞之后，能够很容易地选择出含有两个不同选择记号的共合体。 *2.共合体的概念 由一种具有一个转位子的复制子，同另一种不具转位子复制子融合而成的结构。在其两个复制子结合部位，具有一对同向重复排列的转位子拷贝。;3．柯斯质粒载体的改良 (1)将两个cos位点组入到同一个柯斯质粒载体上???以简化在cosmid上的定向克隆。 (2)构建与通用质粒载体无同源性的柯斯质粒载体 在具重组能力的细胞中同时具有这种载体时，它们之间就不会发生重组，但如果它们各带上同源的外源DNA时，两者之间就会发生重组形成共合体。 (3)使cosmid带上由噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子，这些启动子可在体外合成克隆的插入片段之任意一端的特异性RNA探针。;(4)在cosmid中加入选择性记号，以简化鉴定经重组cosmid转染的真核细胞的步骤。 (5)在cosmid中加入真核基因复制起点，以使转染的cosmid能够在哺乳动物细胞中自主复制。 (6)在cosmid中加入原核标记，以促进转染到哺乳动物细胞内的cosmid序列在细菌中获救。 (7)用噬菌体复制起点代替质粒复制起点，有证据表明如此可缓解由携带ColE1起点的重组cosmid所造成的生长速度不同的问题。;4. 柯斯克隆(Cosmid cloning); (2)理论依据 a. 在?phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点) b. ?phage的多连体分子是由cos连接而成的。 cos cos cos cos cos cos ;c.末端酶(treminase)或叫Ter体系——即?phage具有一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system). *此系统能识别两个相距适宜的(38-54Kb)cos位点，并切割之。 *根据上述分析可知?phage DNA包装的两个必要条件是： cos位点 Ter体系;(3)柯斯质粒包装条件 由于只有在被作用的?DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在38-54Kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。 据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。 因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达38-54K