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高产绒量转基因绒山羊新品种培育任务进展第1页/共66页高产绒量转基因绒山羊新品种培育 内蒙古农业大学承担任务与绒山羊产绒量相关的FGF-5基因毛囊特异表达载体的构建以及转基因细胞系的建立。生产转FGF-5基因的克隆胚胎100枚。培育高产绒量转基因绒山羊5-10只。筛选出2-3个未知的与产绒量相关的功能基因。转基因载体构建和转基因检测第2页/共66页研究进展第3页/共66页一、绒山羊绒毛生长相关基因的获得与筛选第4页/共66页（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库（二）应用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因（三）绒山羊出生2周羊羔皮肤和70天胎儿皮肤差异表达基因的筛选第5页/共66页（一）利用抑制消减杂交法(SSH)构建绒山羊次级毛囊生长期（正）与休止期（反）的两向消减文库第6页/共66页 SSH消减杂交兴盛期毛囊和休止期毛囊cDNA片段互为Tester和Driver，两轮消减杂交后，得到差异表达基因片段第7页/共66页1 2 34 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 255000bp3000bp 2000bp1200kb 800bp 500bp250bp2.差异表达基因cDNA片段的T/A克隆及鉴定 1-12.反库PCR检测结果；13-24.正库PCR检测结果；25.MarkerIII蓝色：约20%克隆质粒中无插入片段随机挑取正反库单克隆各12个，以T7或SP6为引物，经PCR扩增，约80%白色克隆质粒中有插入片段，多数插入片段长度在0.3-1kb，表明文库构建成功第8页/共66页3. 序列测定及结果分析有效序列信息 正向消减文库反向消减文库有效序列(条)313355平均长度(bp)693596Contig数73110注：正反向SSH文库各随机挑取750个克隆进行测序 视大于100bp的合格高质量序列为有效序列第9页/共66页经生物信息学分析，发现与山羊类同源的序列较少，正向SSH消减文库309条序列中，山羊只有57条；反向消减文库344条中，山羊的有35条。因此，所获得的数据，极大丰富了山羊的数据资源。第10页/共66页4. ＊序列注释结果的功能分类 ForwardSSH(224) Reverse-SSH(300) Cell division1513Cell signaling/communication4449Cell structure/motility3052Cell/organism defense1321Metabolism2446Gene/protein expression3337Unclassified6582＊对已知功能基因的ESTs进行分类，共向GenBank注册非冗余ESTs 126条，序列号64970150。第11页/共66页（二）应用cDNA芯片与SSH结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因第12页/共66页在消减文库的基础上，进行了两次荧光交换的cDNA芯片杂交，以筛选差异表达基因，芯片杂交结果见下表生长期休止期差异基因6个10个上调基因 3个9个下调基因3个1个注：主要试剂为晶芯系列产品第13页/共66页生长期次级毛囊的差异表达基因 CloneLength(bp)E-valueEST nameUp-regulated GenesZ3F11463 0.00E+00Bos taurus sortilin-related receptor containing LDLR class A repeats preproprotein (SORL1)Z5D6596e-104Homo sapiens mRNA for fibroblast growth factor receptor substrate 2Z80509未匹配Down-regulated GenesZ5H12251e-111Bos taurus sprouty homolog 2 (Drosophila) (SPRY2)Z1C105859.00E-56Pongo abelii, member RAS oncogene family (RAB11A)Z42199未匹配第14页/共66页 发现6个次级毛囊生长期的差异基因： 上调基因3个：Sortilin、成纤维细胞生长因子受体底物及未知基因1个； 下调基因3个： SPRY2 、 Ras癌基因家族成员RAB11A及未知基因1个。第15页/共66页生长期未匹配 2个Z80TGAGAGCTTTAAAATTCCTGCAATGGTGCAAATTTTCTTAATTGAAAAATAATAAAATAAGGAGGAAAAAA