体内药物分析实验.docx

1.体内药物分析实验 1.1目的要求 掌握血浆样品的前处理方法。 熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。 熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。 1.2主要实验材料与仪器 山奈酚(Kaempferol)及其对照品，黄芩素(baicalein)，抗坏血 酸，肝素，3葡萄糖醛酸苷酶(^glucuronidase)和硫酸酯酶(sulfatase), 分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮 吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格 移液枪(5, 20, 50, 100, 200, 1000 )诲和容量瓶(10, 25mL), 5~10mL 1.3实验原理 1.3实验原理 山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯 的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得， 故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品， 使代谢物水解后测定 苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标， HPLC法测定血浆中山奈 酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。 1.4实验方法 色谱条件：Ci8柱（250mm 4.6mm, 5 ^m）,配保护柱，柱温 40C ；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速1mL/min ;检测波 长370nm;进样量20 ^L 血浆样品处理：取大鼠血浆样品 120 uL加入甲醇20卩1 1% 冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32卩1、怜葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL） 和硫酸酯酶（6U/mL ）的混合水溶液50 uL 37C水浴温育30min后， 加入内标溶液 50 uL然后加无水乙醚 2mL,漩涡混合 5min，于 12000r/mi n离心5mi n;取上清液在氮气流下挥干，残留物用 100 uL 甲醇复溶，12000r/min离心5min,取上清液进样分析。 专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血 浆样品,按“血浆样处理”项下方法处理,照 “色谱条件”项下方法进样 测定。比较所得色谱图,考察血浆内源性物质是否干扰测定,药物及 内标是否达到基线分离。若有必要,适当调整色谱条件,已达到专属 性要求。 标准曲线制备：精密吸取120 uL大鼠空白血浆9份，分别加入 20 uL不同浓度的标准系列溶液，制得0.0 （空白）、0.0 （空白+内标）、 0.05、0.1、0.5、1.5、3和5u g/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度 点平行3~5份）。按血浆样品处理”项下自加1%冰醋酸32 u L起， 同法处理后进样分析,记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值 （R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归 曲线，仅作为对干扰的考察），求得回归方程（R=bC+a）和相关系数 （r）。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值 （C）,与标示值（C） 比较，计算偏差（偏差%= C^C 100% ）和准确度（准确度二 C /C1?0%）o根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ ）。 回收率和精密度试验：精密吸取120 Z大鼠空白血浆，分别加 入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、4卩g/mL 三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行 5份，按 标准曲线制备” 项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线， 求出测得浓度。计算测得浓度与加入浓度的比值，得方法回收率，并 计算各浓度点的相对标准差（RSD）,作为日间精密度；于不同日（至 少3d）重复上述测定，计算日间精密度。 萃取回收率试验：精密吸取120 ^L大鼠空白血浆，分别加入不 同浓度的山奈酚标准溶液，配制0.1, 1和4卩g/mL浓度的山奈酚血浆 样品，每浓度点平行5份，按标准曲线制备”项下方法进行处理，记 录山奈酚峰和内标峰面积，作为萃取后的测定值。另取上述低、中、 高同样浓度的山奈酚甲醇液，加同样量内标溶液，混合，直接于氮气 流下挥干，残留物用100 ^L甲醇复溶，12000r/min离心5min，取同 样量上清液进样分析，获得山奈酚峰和内标峰面积，作为未萃取的测 定值。采用外标法计算萃取后山奈酚峰面积与相应浓度的未经萃取的 山奈酚峰面积比值，得山奈酚萃取回收率；同法计算内标的萃取回收 率。 稳定性实验：精密吸取120 ^L大鼠空白血浆，按 回收率和精 密度试验”项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。考察其在 室温下放置24h （6, 12, 24h取样）、-20C下长期冻存1个月（10, 20, 30d取样）、反复冻融（-20C —室温）3次的稳定性，将测得结 果与0时的结果进行比较，计算 RSD。并考察测定溶液的稳定性， 即样品制备后到进样分析的放置时间（6，12，24，36，48h）的稳定 性。 血浆样品测定：将山奈