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生化实验质粒DNA提取2、严瑾型质粒:严瑾型质粒的复制需要一个质粒编码的蛋白,质粒的拷贝数不能通过氯毒素等蛋白合成抑制剂来增加。质粒类型质粒按复制方式能够分为两种类型: 1、松弛型质粒:松弛性质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白,完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶,即使蛋白质合成受到抑制,质粒的复制依旧进行。质粒的应用1、大多数基因工程使用的是松弛型质粒2、严瑾型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。3、质粒的特点使质粒成为外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种基因工具在基因过程中具有极其广泛的应用价值。质粒的性质中与载体作用关系紧密的包括: 1、质粒的复制型 2、质粒的不相容性 3、质粒的接合性 4、/s?q=%E5%A4%9A%E5%85%8B%E9%9A%86%E4%BD%8D%E7%82%B9ie=utf-8src=wenda_link多克隆位点 5、筛选标记 1、质粒能在细菌中垂直遗传,同时赋予宿主细胞一些表型,是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用,从雄性体转移到雌性体,是细菌有性繁殖的性因子,1952年由Lederburg正式命名为质粒。质粒特点质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的,但能够赋予细菌一定的表型,如抗药性等。 它是基因操作工程中常用工具中载体的一种。是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。 人工基因工程获得胰岛素 首先获得胰岛素基因,再将胰岛素基因转入大肠杆菌内,再创造大肠杆菌增殖的有利环境,对大肠杆菌进行大规模培养,使之产生大量的治疗糖尿病的药物--胰岛素,提取纯化。分离质粒DNA的方法从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法众多,目前常用的有:1、碱裂解法2、煮沸法3、SDS法4、羟基磷灰石层析法……这几种方法概括起来说主要采纳非离子型或离子型去污剂,有机溶剂或碱进行处理及加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离质粒DNA选择哪一种方法取决于以下几个因素: 1、质粒的大小 2、大肠杆菌菌株 3、裂解后用于纯化的技术和实验要求各种方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构结构等特点加以选择的,其中碱变性法既经济且回收效率高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接和转化。质粒DNA的提取实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。实验原理 质粒 (plasmid) 共价、闭合、环状的小分子量DNA; 能在宿主细胞内独立自主复制; 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 质粒的复制类型 严瑾型: 只在细胞周期的一定时期进行复制,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1-2个质粒。 松弛型: 质粒在整个细胞周期中随时能够复制,当染色体复制停止后,质粒仍然能接着复制,每个细胞中含有10-200个拷贝。 载体(Vector)能自主复制;有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;具有两个以上的遗传标记,便于重组体的筛选和鉴定;分子量小,以容纳较大的外源DNA、 质粒提纯思路质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质:蛋白质、基因组DNA、RNA 碱裂解法 碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。实验原理分析染色体DNA 碱性 条件 变性 质粒DNA碱裂解法 在pH值高达12、6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链可不能完全分离,当以pH4、8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。1、手工碱裂解法抽提质粒平衡酚:氯仿:异戊醇 = 25:24:1 氯仿使蛋白质变性并分离水相与有机相。平衡酚使DNA在上清中(pH=7、8, 酸性下DNA位于有机相,酚的密度大)。异戊醇可消除出现的泡沫。50 mM葡萄糖, Tris·HCl (25mM, pH8、0), 10 mM EDTA 分散细胞,鳌合金属离子使金属酶失活0、2 M NaOH, 1% SDS 碱性水解细胞壁肽聚糖,核酸和蛋白质变性5 M KAC 酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS和染色体DNA沉淀无水乙醇: 除去DNA水化层,沉淀DNATE (Tris + EDTA)缓冲液: 溶解DNA2、质粒提取试剂盒(离心柱型)最后低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。EB溶解DNA