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LOGO 原位PCR技术在兽医中的应用 生物技术在兽医方面的应用 Contents PCR的基本原理 1 PCR反应五要素 2 PCR的步骤 3 PCR反应特点 4 PCR技术研究新进展 5 PCR仪器的发展 6 在兽医分子生物技术中的应用 7 1.1 PCR的基本原理 聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 1.2 PCR的基本原理 变性 退火 延伸 PCR的基本步骤 2、PCR反应五要素 引物 酶 dNTP 模板 缓冲液 即 PCR反应的五要素 3. PCR的步骤 1 DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 4、PCR反应特点 PCR反应特点 特异性强 对标本的纯度 要求低 灵敏度高 简便、快速 4.1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： 　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　②碱基配对原则； 　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　④靶基因的特异性与保守性。 4.1 特异性强 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 4.2 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 4.3 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 4.4 对标本的纯度要求低　　 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 5、PCR技术研究新进展 简并PCR的原理 基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库，从不同生物物种中扩增出未知核昔酸序列的基因。 简并PCR 简并PCR的应用 找到进行PCR的基因序列，就会发现新基因。 基因表达的检测、病毒的检测、基因组研究等。 6、PCR仪器的发展 pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin –elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。 国内外生产的几种DNA扩增仪 7、原位PCR在兽医生物技术中的应用 1. 检测病原体 2、观察病原体在体内的 分布规律 3、检测导入基因 原位PCR在兽医生物技术中的应用 LOGO