PCR仪原理及其应用.ppt

PCR仪的原理及其操作应用 §1.PCR仪的技术原理 §2.PCR仪的分类与应用 §3.PCR仪的操作步骤 轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授 第一页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 §1.PCR原理简介 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 第二页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意图 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 第三页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 第四页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA Polymerase ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的DNA 链。 第五页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Sequence Target Sequence 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 第六页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 Target Amplification No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 第七页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 §2.PCR仪的分类与应用 普通PCR仪：一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，如果要做不同的退火温度需要多次运行。 梯度PCR仪：一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。 第八页，编辑于星期二：十七点 四十三分。 原位PCR仪：用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。 实时荧光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集