多位点序列分型.pptVIP

2.核酸序列信息的获取 2.1样本来源 54株结肠弯曲菌(C.coli)分离于2002年零 售禽肉中，均为不重复菌株 2.2PCR扩增 2.3测序 第二十八页，编辑于星期二：十五点 分。 3.结果分析 3.1.MLST数据提交 将测序序列在线递交至弯曲菌MLST数据库 ()进行分析,得出等位基因型、序列型以及序列型克隆系。 第二十九页，编辑于星期二：十五点 分。 第三十页，编辑于星期二：十五点 分。 3.2UPGMA分析ST序列型的发育树 第三十一页，编辑于星期二：十五点 分。 谢谢！ 第三十二页，编辑于星期二：十五点 分。 * * * * * * * * * * * MLST最早应用于脑膜炎奈瑟菌就是从11个备选基因中选出6个基因，后来出于流行病学原因增加一个位点(fumC) * * * * * * 多位点序列分型 MultilocusSequencingTyping MLST 第一页，编辑于星期二：十五点 分。 Contents 两种分型方法的比较 MLST的步骤 MLST的方案设计 MLST的由来 实例分析 第二页，编辑于星期二：十五点 分。 多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE） 根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异 选定管家酶 淀粉胶检测 不同电泳迁移速率 电泳谱 等位基因的变异性 揭示微生物基因多样性 第三页，编辑于星期二：十五点 分。 MLEE的缺点 不能推断特殊位点的碱基序列 不同实验室间的分型结果不能进行比较 第四页，编辑于星期二：十五点 分。 MLST的首次使用 MLST是由多位点酶电泳(MLEE)衍生出来的 一种分型方法 在1998年,Maiden等首次将MLST应用于脑膜炎奈瑟菌分型 第五页，编辑于星期二：十五点 分。 多位点序列分型 （MLST） 一种基于核酸序列测定的细菌分型方法 通过PCR扩增多个管家基因内部片段 测定其序列，分析菌株的变异 第六页，编辑于星期二：十五点 分。 MLST的原理 MLST方法一般测定6~10个管家基因内部400~600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱 ，也即是这株菌的序列型（sequence type,ST）。这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息 。 第七页，编辑于星期二：十五点 分。 序列型（ST） 序列型（ Sequence-typying, STs ）等同于MLEE得出的电泳型(Electrophoretic type, ET） 通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同 第八页，编辑于星期二：十五点 分。 MLST分析方法 MLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值, 然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类型(sequence types, STs)鉴定， 再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统树图进行聚类分析。 第九页，编辑于星期二：十五点 分。 MLST方案的设计 三要素： 选择经过初步筛选的菌株 选择具有独特特征的基因位点 设计用于基因扩增和序列测定的引物 第十页，编辑于星期二：十五点 分。 1. 菌株的选择 根据已有的分型方法和流行病学资料，选择100株左右具有代表性的菌株作为分析对象。 理论上，这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体，而不是仅仅包含那些对人致病的克隆。 收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一个亚型组成。 第十一页，编辑于星期二：十五点 分。 2.管家基因的确定 全基因组序列的测定大大方便MLST位点的选择一般选择10到20株菌评价10至15个备选位点。 最终采用 7个位点进行后续实验和分析。 如果需要提高分辨力，可以加入个别非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，这样比增加管家基因的个数将更有效 第十二页，编辑于星期二：十五点 分。 3.引物的设计 目的片段长度：400~600bp 所有引物调整为同一退火温度， 以适用于大范围流行病学监测和群体研究 为了发现引物结合位点可能存在的变异， 每个位点都应该设计一对以上引物 第十三页，编辑于星期二：十五点 分。 / 实际运用中，对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取方案。 / 第十四页，编辑于星期二：十五点 分。 第十五页，编辑于星期二：十五点 分。 第十六页，编辑于星期二：十五点 分。 第十