Rt-PCR实验步骤和反应体系优化知识.pdfVIP

RT-PCR 实验步骤 一、实验器具与材料： 1、移液枪： 1ml、200 μl、20 μl、10 μl、2 μl 2、吸头： 1ml、200 μl、20 μl 3、匀浆管： 5ml 4、吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 20 μl吸头的一个 5、EP 管： 1.5ml、0.2ml、100 μl 6、试剂瓶： 2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒： 50ml、250ml、500ml 8、容量瓶： 250ml、500ml、1000ml 9、试管架： 5ml、1.5ml、20 μl 10、盐水瓶： 250ml、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装 DEPC 水 11、铝制饭盒： 4 个 12、塑料小饭盒： 1 个 13、大瓷缸： 2 个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸： 2 卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、 EP 管、匀浆管等） 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头 需要吸管打入 DEPC 水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入 吸头台，再高压一次（ EP 管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（ DEPC 水泡）（洗净后 先泡 1‰DEPC 过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡 DEPC ） 三、试剂配制： 1、DEPC 水：吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1‰DEPC 水，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时备用。 2、75% 乙醇：用无水乙醇 DEPC 水配，然后放 -20℃保存（其中 DEPC 水需先 高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml ？ pH8.0 蒸溜水 1000ml 5 ×TBE （贮存液） 再将 5×TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取 50ml 贮存液 450ml 水--→500ml 工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青 FF 30% 甘油 6 ×缓冲液， 4 ℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0% ： 1.0g 琼脂糖 100ml 电泳缓冲液， 微波炉中火 30 秒至沸腾， 熔化的琼脂物冷却至 60℃时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5 μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子 的胶膜中，在室温下放置 30-45min 后现进行电泳。 2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为 1.5g 六、需购置的 Rt-PCR 材料： （生工. Tel. 2236106.） Taq 酶（含 MgCl2 Buffer ） 200u 70.00 dNTP: 1 支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1 支 110 -- -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies -- 4℃ Marker: 10 μg 0.2 μg/ml 150.00科威 （1543. 994. 697. 515. 377. 231） 七、引物合成 正义： 5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC- 3′ 反义： 5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT- 3′ 2、par-4: 正义： 5′-GGGACCTCGGAACTCAAC- 3′