MTT-CCK8法细胞活力检测及药物IC50计算.pdfVIP

MTT/CCK8法细胞活力检测及药物IC50计算 1 细胞活力检测目的 2 MTT/CCK8实验原理与方法 目录 3 数据分析与注意细节 4 药物IC50的计算 细胞增殖与细胞毒性 细胞活力（Cell Viability ）：细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的 百分比。细胞活力检测通常包括细胞增殖检测和细胞毒性检测。 细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发 育、繁殖以及遗传的基础。 细胞毒性是由药物或化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 Drug/Ray 细胞增殖示意图 细胞毒性示意图 细胞活力检测的目的 检测目的： 1）由组织中分离细胞检查活力以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。 2 ）复苏后的细胞也要检查细胞活力，了解冻存和复苏的效果。 3 ）细胞毒性检测，明确药物或射线等对细胞毒性的影响。 4 ）细胞增殖能力检测，基因上调或下调后对细胞增殖能力的影响。 对照组 实验组 计算公式：细胞存活率= （细胞总数-死细胞数）/细胞总数×100% 细胞增殖检测方法 直接计数法： 利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对各组细胞数目进行比较。 优点：简单，不需要特定的仪器和试剂；准确。 缺点：不适合样本数量多的情况。 胸腺嘧啶核苷（3H-TdR ）渗入法： TdR是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即H-TdR作为DNA合成 的前体能渗入DNA合成代谢过程，通过测定细胞DNA链内标记核苷酸的量的放射性强度，可以反 映细胞DNA 的代谢及细胞增殖情况。 优点：敏感性高，容观性强，重复性好。 缺点：需要一定设备条件，存在放射性核素污染问题。 细胞增殖检测方法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu ）检测法： Brdu是胸腺嘧啶（T ）的衍生物，可代替T在DNA合成期（S期）掺入DNA链，活体注射或细胞培养加入， 而后利用特异性抗体，显示增殖细胞。同时结合其他细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类、增殖 速度等。不仅能用于体外实验，还能用于活体实验，但需要变性DNA后才能与抗体结合，破坏了DNA双链结 构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。 5-乙炔基-2 ’脱氧尿嘧啶核苷（Edu ）检测法： Edu是一种胸腺嘧啶（T ）类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过Edu与荧光染 料的特异性反应检测DNA复制活性，反应细胞的增殖情况。 Edu染料只有Brdu抗体大小的1/500，在细胞内容易扩散，无需DNA变性即可有效检测，避免样品损伤，在细 胞和组织水平能更准确的反应细胞增殖。 细胞增殖检测方法 MTT/CCK8法： 利用线粒体内部酶的活性其量与细胞数呈正比，将特定的四唑盐类进行转化，显色，通过酶标仪 进行检测。 细胞毒性检测方法 染色排除法： 利用特殊染料使死细胞着色，以达到区分活细胞和死 细胞的目的，从而计算细胞存活率。 台盼蓝法:死细胞染成蓝色，活细胞不着色 苯胺黑法:死细胞染成黑色，活细胞不着色 LDH法细胞毒性检测： LDH （乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细 胞外，LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT （四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过酶标仪进行检测 。通过检测细胞培养上清中LDH 的活性，可以判断细胞的损伤程度。 荧光素发光法检测： 腺苷酸激酶（AK ）存在于所有的真核和原核细胞的胞浆中，AK可以激活ADP生成ATP 。当细胞受损后，细 胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。利用荧光素酶和荧光素在ATP 的作