外周血单核细胞诱导多能干细胞.docxVIP

外周血单核细胞的培养 采血：采集5-10ml猴子的外周血，加入抗凝素，轻轻混匀。（动物部负责 采集好的血液管外经过75%酒精消毒，带进细胞室。在50ml离心管中加入6ml血液，再加入两倍体积的PBS稀释，轻轻混匀。 另取新的一个50ml离心管，加入15ml Ficoll-Paque Premium 分离液，管倾斜45度，将稀释后的20ml血液（总体积不到20ml，用PBS补齐20ml，使总体积达到35ml）在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。（红细胞会沉入离心管底部，这是正常的,因为红细胞密度比聚蔗糖高。） 在室温下（25℃）以400g离心30min（降速的时候要注意离心机的震旦为0），离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。 小心将上层吸弃，将第二层液体吸到一个新的50ml离心管中，加入20ml的PBS，于4℃,350g离心10min。 吸弃上清液，加入5ml红细胞裂解液，在室温下孵育10min。然后用PBS补齐50ml，于4℃,350g离心10min。 弃上清液，用25mlPBS重悬，于4℃,350g离心10min。 重复7步骤，再洗一次。 弃上清液，用5mlPBS重悬，于4℃,350g离心10min. 以1：10的稀释度计算细胞数量。 加入细胞培养皿扩大培养细胞。 试剂 Ficoll-Paque Prem