CTAB法提取基因组DNA.docxVIP

CTABt[30]提取玉米（或其它植物）基因组DNA 1）取~1g玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL2%65C保温的2XCTAB抽提液,混匀，65r保温30?60min。 2）加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）,轻缓颠倒混匀，10000r/min,离心5min 3）取上清，加入1/10体积（约）的65E的10XCTAB/NaC溶液，颠倒混匀。 4）用等体积的氯仿/异戊醇（24:1）抽提，10000r/min，离心5min。 5）取上清，加入（正好）等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如沉淀可见，继续做下步，否则，65r保温30min。 6）4r，2700r/min，离心5min。 7）去上清，用高盐的TEbuffer重悬（?）。（可65E保温30min,至大部分溶解）。 8）加入体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4r，10000r/min，离心15min。 9）去上清，80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TEbuffer重悬。 高盐的TEbuffer 终浓度 配制50ml 10mM, (1M 母液） 0.1mMEDTA, (0.5M 母液） 1MNaCl 1.8g 室温可保存几年 ctaB提取液 终浓度 配制200ml 2%(W/V)CTAB 4g 100mM, 20ml(1M 母液） 20mMEDTA, 8ml(0.5M 母液） 1.4MNaCl 10.22g 室温可保存几年 10XCTAB/NaC溶液（10%CTAB/0.7MNaCl） 在80mlH2O中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10gCTAB同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65r溶解。定容至100ml。 CTAB沉淀液 终浓度配制100ml1%(W/V)CTAB50mM 终浓度 配制100ml 1%(W/V)CTAB 50mM, 10mMEDTA, 1g 5ml(1M 2ml(0.5M 母液） 母液） 室温可保存几年 CTABt提取植物干品（或真菌）基因组DNA（自己改进版） 10）取0.2g叶片，加入液氮粉碎，加入800卩L2%65C保温的2XCTAB抽提液，混匀，65C保温30?60min。 11）加入600^L的氯仿/异戊醇（24:1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。 12）取上清（约600^L），加入1/10体积（约60卩L）的65C的CTAB/NaC溶液，颠倒混匀。 13）用等体积（约600^L）的氯仿/异戊醇（24:1）抽提，10000r/min，离心5min。 14）取上清（约450卩，加入体积的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20C保温10~20min）。 15）4°C，12000r/min，离心10min。 16）去上清，用高盐的TEbuffer重悬（约100卩L），（可65C保温30min,至大部分溶解，加（1卩L）RnaseA（10mg/mL）37C30-60min。 17）加入体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20C保温10~20min）,4C，12000r/min，离心15min。 18）去上清，70%L醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TEbuffer重悬（30~60卩L）。 以％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检 测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测0臥和0氐，并计算ODWOD^o的比值）。 CTAB法提取植物基因组DNA（改进版） 19）取0.2g叶片，加入液氮粉碎，加到2ml离心管，加入1000卩L2%65C保温的2XCTAB抽提液，混匀，65C保温30?60min。 20）加入900^L的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀，12000r/min，离心15min。 21）取上清（约850^L），加入1/10体积（约85卩L）的65C的CTAB/NaC溶液，颠倒混匀。 22）用等体积（约850^L）的氯仿/异戊醇（24:1）抽提，12000r/min，离心15min。 23）取上清（约700^L），加入等体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，（-20C过 夜）。 24）4°C,12000r/min，离心20min。 25）去上清，用高盐的TEbuffer重悬（约400卩L）,（可65C保温30min,至大部分溶解，加（4-6卩L）RnaseA（10mg/mL）37C30-60min。 26）加入等体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（-20C1-2h），4C，12000r/min，离心20min。 27）去上清，75汇醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的ddHO重悬（30~60卩L）。 以％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检 测DNA屯度（将DNA稀释50倍后分别测OD6。和OR。，并计算ODVOD^的比值）。