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His标签融合蛋白纯化步骤 （ni-nta琼脂糖凝胶亲和层析纯化法） 1.缓冲液制备 ◆lysisbuffer1(undernativecondition)0.5mmtris.hcl0.5mnacl 5%（w/v）甘油咪唑 100mg(1mg/ml)lysozyme(purificationof6xhis-taggedproteinsfrome.coli) 1%非IDETP40（np40=igepalca-630）0.25%吐温20（或利顿100）0.02%nan3（可选） 200μg(2μg/ml)rnasea(optional)1mg(10μg/ml)dnase1(optional)50mmnaf(optional)1mmna3vo4(optional) +DDH2O至100ml，调整pH值至8。使用氢氧化钠 此lysisbuffer适用于从e.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带his标签的蛋白质。仅在用于裂解e.coli细菌时，加入溶菌酶。 Na3VO4是一种磷酸酶抑制剂，可保护磷酸化蛋白质不被磷酸酶还原。NaF是一种酯酶抑制剂，可保护脂蛋白免受酯酶降解。 注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带his标签的蛋白时，缓冲液中不能加edta，因edta能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。 ◆赖氨酸缓冲液2（变性条件下） 50mmtris-cl 8毫升尿素（或6毫升盐酸）10毫升咪唑。05%吐温20 adjustphto8.0usingnaoh ◆透析/脱氯缓冲液 50mmtris-cl,ph8.0 100mmnacl（依赖于可溶性蛋白质）2.5%甘油0。5mmedta 0.5mmdttortcep ◆ 缓冲区a： 50mmtris.hcl 0.5mnacl5%甘油。05%吐温20 用高浓度hcl调节ph值至8.0。 ◆ 缓冲液B（洗脱缓冲液）： 50mmtris-cl 0.5mnacl5%甘油。05%吐温咪唑 用高浓度hcl调节ph值至8.0。 ◆ 缓冲液C（咪唑梯度洗脱液）：按以下不同比例制备缓冲液a和缓冲液B（100ml） 2.样品预处理： 通过离心收集的细菌应以每克湿重细菌4~5 mLLysisbuffer的比例完全悬浮，并放置在-80℃的冰箱中过夜；细菌在4℃下裂解，并在旋涡处悬浮。在400W功率下，每个循环进行5秒的超声波处理，并冷却5秒10分钟。细菌共破碎两次；在4℃和12000rpm下离心30min，收集上清液或使用0.45μM滤膜，用低浓度NaOH调节pH至8.0进行纯化。 3.操作步骤 ◆ 媒体平衡与亲和力 取1mlni-nta琼脂糖凝胶（金益肽tmnta货号：jyt-m0007），置入15ml离心管中，2000rpm离心2min，移去上清液；加入5mllysisbuffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5ml细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4oc低速旋转1小时。 （每个品牌的Ni柱负载量不同。金一肽tmni nta琼脂糖凝胶负载量40mg/ml，请根据目标蛋白浓度、分子量和体积选择合适的Ni nta琼脂糖凝胶。 1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析 对于柱中的空气，首先将垫圈完全浸入水面下，小心地将其推到底部，同时保持水平，以避免垫圈下出现气泡。 2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口， 用移液管吸收与样品有亲和力的培养基，并将培养基加入色谱柱；让培养基在4oC下静置10分钟后自然沉淀。 3)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫 气泡保留在薄板和介质之间的接触面上（如果实验要求不是很严格，则可能不覆盖垫片以提高流速）。4） 使用一段时间后，如果色谱柱流速减慢，首先用小镊子沿边缘翻转垫片，夹紧垫片， 倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。◆洗柱： 色谱柱中未结合的蛋白质用5~10倍体积的含有10mM咪唑缓冲液C的培养基洗掉；保留洗涤液，待SDS电泳检测不到目标蛋白后丢弃。◆ 洗脱： 用含20、50、250mm咪唑的缓冲液c分步洗脱，每个梯度2~3倍介质体积洗脱，分别收集洗脱样品，sds电泳检测蛋白质； 注：净化过程中流速不宜过快。对于1ml