4 生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术).ppt

整理课件 CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。 用供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光 蛋白质控制和调节着细胞中诸多的生命活动，尽管有一些蛋白质主要以单体的形式发挥作用，但确有相当大部分的蛋白质，却是通过与别的配体分子结合或作为一个大的生物复合物中的一部分来参与细胞中的生命活动的。 了解生物体细胞的功能必须从孤立情况下和在与别的蛋白质相互作用的情况下两个层此上来认识蛋白质的功能。 （1）蛋白质结构和序列特点，包括其明确的结构模式，这些信息可用于按照功能分类和推测蛋白质间相互作用的模式； （2）蛋白质进化过程和保守序列，这有利于确定一些关键的残基； （3）蛋白质的表达谱，包括产生该蛋白质的细胞类型和丰度，以及在细胞进程或疾病过程中蛋白质表达谱法的变化； （4）蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构； （5）蛋白质翻译后修饰方式（磷酸化、泛素化、乙酰化等）； （6 ）了解与其相关联的其他细胞蛋白质。 实际上，上述前5个方面的信息决定了该蛋白质的第6个特征。 因此，对于一个蛋白质相互作用谱的认识是最终了解细胞中该蛋白质功能最重要的一步。目前在细胞的信号转导、肿瘤生物学和药物遗传学等诸多学科里，蛋白质相互作用分析已经成为了重要的组成部分。 第一类，目标是鉴定与某个感兴趣的大分子相互作用的所有可能分子。在这种情况下，为了在一个大的范围内进行筛选，暂时不考虑生理学方面的重要性。第二类，与所关注的分子有相互作用的大分子已经被鉴定出来，接下来的目标是详细描述其生理功能及其相互作用对其功能的影响，即确立生理学上的意义。在这种情况下，在尽量接近胞内的条件下研究其相互作用非常关键。第三类，已经鉴定出存在的相互作用且在生理状态下得到了验证和合理的解释。在这种情况下，目标是设计一些高通量的方法能够鉴定出一些按照人们所期望的方式来调节这种相互作用的关键因子。没有一个技术适用于所有的这些领域；然而组合这些技术，就可能取得大的进展。 可用于抗体制备、蛋白质-蛋白质相互作用 以及生物分析。 Glutathione immobilizes the tagged protein partner which in turn pulls down the interacting protein. bait诱饵蛋白 Prey捕获蛋白 1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。 （2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中， 4℃, 摇床孵育过夜。 （3） 孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。 （4） 把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心20min,收集上清液。 （5） 将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。 （6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 （7） 加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min. （8） SDS,Western Blot或质谱仪分析。 （9） 对照（GST）同样处理。 当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。这一事实可已经用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质间的相互作用。 因此，他可能不适合于检测构成巨大的、不溶性的大分子结构的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，核和胞外基质。 如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，在细胞内于X稳定结合的蛋白质Y也可能被沉淀下来。蛋白质Y的沉淀，是基于与X的物理性相互作用，被成为免疫共沉淀。该方法最早的一个例子是SV40 T抗原的抗体和腺病毒Ela的抗体来鉴定与病毒转化的癌蛋白相互作用的宿主细胞蛋白质。 （1） 转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清。 （2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜。 （3） 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min。 （4） 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。