备课素材：影印平板培养法--高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.docxVIP

影印平板培养法 2016 全国Ⅰ卷37题：某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到 Ampr 或 Tetr 中会导致相应的基因失活（Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr 表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用 BamH I 酶切后，与用BamH I 酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题： （1） 质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有 （答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。 （2） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ；并且 和 的细胞也是不能区分的，其原因是 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是 的固体培养基。 答案： （1） 能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可） （2） 二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒 （或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 在含有氨苄青霉素的培养基中，未被转化的和含有环状目的基因的大肠杆菌因无氨苄青霉素抗性基因而不能存活，所以不能区分；含有质粒载体的和重组质粒的由于具有氨苄青霉素抗性基，能在该培养基上生存。所以在上述筛选的基础上，还需要进一步筛选出含重组质粒的大肠杆菌。 为什么加入四环素就能筛选出含重组质粒的大肠杆菌呢？不少学生（包括部分教师）会产生这样的疑问：由于目的基因插入到四环素抗性基因内部从而导致该基因失活，加入四环素不就把含有重组质粒的大肠杆菌杀死了吗，怎么还能够将其筛选出来呢？其中，实际上运用了一种方法——影印平板培养法。 影印平板培养法是一种通过盖印章的方式，达到在一系列培养皿平板的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种和培养方法。1952 年，莱德伯格夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》，以确切的事实证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。 莱德伯格影印平板培养法的实验过程如下：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有一层灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其均匀地沾满来自母培养皿平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。经培养后，对各平板相同位置上的菌落进行对比，就可选出适当的突变型菌株。因此通过影印平板培养法，就可以从非选择性条件下生长的细菌群体中，分离到过去只有在选择性条件下才能分离到的相应突变株。 如何通过影印平板培养法筛选出含重组质粒的大肠杆菌呢？如图 2 所示，简单地说，将原始菌种（含质粒载体的大肠杆菌和重组质粒载体的大肠杆菌）接种在不含药物的普通平板表面，待其长出密集的菌落后，用影印法接种到含四环素的平板上。由于含重组质粒的大肠杆菌在含有四环素的选择培养基上不能生存，故在该平板上相应位置没有菌落出现；比较平板 2 和 3，就可以在平板 2 上的相同位置找到含重组质粒的大肠杆菌。把平板 2 中相应位置的菌落挑选至普通培养液中继续扩大培养，再涂布到平板 5 上，重复以上步骤，最终就可以得到纯度较高的含重组质粒的大肠杆菌。