蛋白质双向电泳及质谱技术.pptxVIP

1;蛋白质双向电泳技术;双向电泳简介;;双向电泳具体步骤;为什么要进行样品制备; 1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。 2 最大限度减少样品的损失 低温???存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。;样品制备流程及注意事项;样品的破碎;温和破碎法;剧烈破碎法;作用 去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性 关键-可溶性 获得可以重新溶解的蛋白 常用方法 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提 ;样品中杂质的去除;DNA/RNA的去除;其他杂质的去除;样品的溶解;增加样品溶解性的手段;样品液的准备;IPG 用两亲性电解液的组成;样品制备注意事项;;固定pH 梯度(IPG)示意图;宽pH梯度及窄pH梯度;IPG 胶的重泡涨及上样;蛋白载样量;第一向：等点聚焦;IPG 胶条的平衡 ; 使被分离的蛋白质与SDS完整结合;胶体考马斯亮蓝染色 灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 可实现PAGE的无背景染色 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 胺基黑染色 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 银染 可减少胶内蛋白质产量 对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响 ;银染色;负染 主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 胶体扩散染料 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色;有机荧光团染料 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料 可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 金属螯合染料 与现代蛋白质组学研究相兼容的 专门与常用微量化学表征过程兼容 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合 ;凝胶的图像处理分析;目前双向电泳需解决的问题;对于双向电泳的建议;蛋白质质谱技术;质谱基础;质谱的评价指标;;;强的抗背景干扰能力 极高的检测灵敏度和准确度 可用来分析复杂混合物中的蛋白质 丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质;1、鉴定和注释蛋白质的路线 ;; 肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因; 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 ;;组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） ;2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略 ; 3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法;(1)亲和层析耦联质谱技术 ;先决条件 ;利用含靶蛋白的融合蛋白获得相互作用蛋白质;主要优点 ;(2) 免疫共沉淀耦联质谱技术 ;研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白;特 点 ;局 限 性;Biacore基于表面等离子共振(SPR)进行生物大分子相互作用分析(BIA) 质谱(MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS )鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子 ; Biacore的基本工作原理;(4)串联亲和纯化耦联质谱技术 ;主要流程; ↓ 耦联钙调素的亲和柱纯化 ↓ 洗脱 ↓ 含EGTA的洗脱液洗脱 ↓ 质谱鉴定结合蛋白质 ;特 点;Thank You!