米曲霉的培养及蛋白质的分析.ppt

整理ppt 米曲霉的培养及蛋白质的分析 一、实验目的 通过固态三角瓶培养曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法 二、实验原理、过程和方法 1、实验原理 2、实验过程 3、实验方法 1、实验原理 固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。 固态培养方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。 固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。 固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染菌问题未得到根本解决。 本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征： 米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。 2、实验过程 米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。 3、实验方法 米曲霉的培养 本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。 试管斜面培养基： 豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。 或采用马铃薯培养基：马铃薯200g 葡萄糖20g 琼脂15-20g 加水至1000ml pH自然。 米曲霉的培养基1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml； 米曲霉的培养基2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml； 装料厚度：1cm左右； 灭菌：120℃，30-60min； 三角瓶培养基制备： 接种及米曲霉的培养条件： 米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。 固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为48-70小时。 三、实验仪器、设备和材料 恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。 米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉） 四、实验分析项目和方法 1、 米曲霉培养效果测定： 米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上； 2、干物质失重的测定 干重失重＝发酵前干重－发酵后干重 3、米曲霉蛋白酶活力的测定 3.1 原理 （1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈蓝色反应。 （2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)。 （3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计测定。 （4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 3.2 试剂 （1）福林试剂 于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。 （2）0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液 称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。 （3）0.4mol/L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.