还原糖含量试剂盒说明书.docVIP

PAGE / NUMPAGES 货号：QS2609? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 规格：50管/24样 还原糖含量试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、果糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物，也是进一步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。 测定原理： 加热促进碱性溶液中3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征吸收峰；在一定的浓度范围内，还原糖含量与540nm吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出样品中还原糖的量。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：100mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：20mL×1瓶 ，4℃保存； 样品中还原糖的提取： 1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议1000万细菌或细胞加入2mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3S，间隔10S，重复30次），转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。 2、组织的处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.2g组织，加入2mL试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。 3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.2mL血清（浆）加入2mL试剂一），冰浴匀浆，转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中40min并且振荡8~10次，8000g，25℃离心10min，取上清供测定用。 测定步骤： 1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2、 调节水浴锅至95℃。 3、 在EP管中加入下列试剂： 试剂（μL） 对照管 测定管 样本 700 700 试剂二 ? 500 蒸馏水 500 ? ? ? ? 将各管摇匀，在95℃水浴中加热5min（盖紧，防止水分散失），取出后立即冷却至室温，混匀。在540nm波长下读取对照管和测定管吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。 注意：1、每个测定管需设一个对照管。 2、如果ΔA大于2，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。 还原糖含量计算： 1、标准条件下测定回归方程为y = 8.5067x-2.0807；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。 2、按样本鲜重计算： 还原糖(μg/g鲜重)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)=235×(ΔA＋2.0807)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 还原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)=117.55×(ΔA＋2.0807)÷Cpr 4、按细菌或细胞密度计算： 还原糖(μg /104 cell)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（1000×V1÷V2）=0.235×(ΔA＋2.0807) 5、按血清（浆）体积计算： 还原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（V3×V1÷V2）=1175.5×(ΔA＋2.0807) 1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入样本体积，0.7mL；V2：加入提取液体积，2 mL；V3：加入血清（浆体积），0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1000：细菌或细胞总数，1000万。 注意：最低检测限为1mg/g鲜重或10μg/mg prot