间接法Elisa汇总分析和总结.pdfVIP

间接法ELISA SOP 一、包被 1．抗原包被量为20µg/板。 2 ．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。 3 ．取25µl 抗原与20mlCBS （抗原包被液）混匀，100µl/孔。 4 ．包被完毕后，4℃过夜。 二、封闭 1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。 2 ．加封闭液，200µl/孔。 3 ．37℃孵育2h。 4 ．甩干，洗板（3次）。 5 ．用干燥的自封袋4℃保存。 【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200µl -300µl 洗板液，静置2min，甩出，将板拍在 干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。 三、一抗 1．可洗板一次。 2 ．阳性对照：1µl 阳性血清加入1ml 抗原稀释液中，做1：1000 稀释（第一孔）。 3 ．阴性对照：做1：2 万稀释。 用1µl 阴性血清加入100µl 抗原稀释液中，先做1：100 稀释。再从此液 取出5µl 加入995µl 的抗原稀释液中，最终稀释为1：2 万。 4 ．空白对照：只加抗原稀释液。 5 ．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100µl 抗原稀释液。 6 ．第一孔加100µl （1：1000）的阳性对照。 7 ．第二孔加100µl （1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100µl 加到3 号 孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。 1：1000 1：2000 1：4000 1：8000 1：16000 1：32000 阴性对照（1：2 万） 空白对照 8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。 【注】：①通常在第一次做Elisa 时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数 (一般认为吸光值小于0.1 的阴性稀释倍数为易) 。 ②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。 ③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。 四、二抗 本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1．用0.01MPBS做1：5000 稀释（现用现配）。 2．100µl/孔。 3．酶标板37℃孵育30min, 洗板3 次。 【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗 就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。 五、显色 1．显色液参照底物配制表。 总体积 (ml) 10 8 6 4 2 A+B 混合液(ml) 10 8 6 4 2 TMB (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.75%H O (µl) 32 25.6 19.2 12.8 6.4 2 2 2．100µl/孔。 3．酶标板37℃孵育15min，不洗板，直接加终止液。 【注】：①最后显色阳性、阴性、空白都没有一点颜色，很有可能是二抗或者显色剂出了问 题。其次还有可能是包被或封闭出了问题，那最后只能是一抗不能和抗原结合了（可 能性较小）。 ②最后显色阳性、阴性、空白都有颜色，可能是，（1）阳性的显色结果是非特异结 合；（2）阴性稀释不够，或者本身阴性血清就含有可以和抗原结合的物质（动物的 个体差异造成）；（3）洗板没洗干净，可以增加洗板次数和时间，提高洗板效果。 ③出现“跳孔”即，抗体的吸光值并不是根据稀释梯度逐级递减，可能是在做梯度 稀释的时候出现了失误（一般新手的较易出现这种情况）。 六、终止 终止液为2M的HSO 。 2 4 100µl/孔，终止后立即用酶标仪检测，波长为450nm下记录实验结果。 分析抗体效价。 如， 稀释倍数 抗体 1:500 3.138 1:1000 2.957 1:2000 2.351 1:4000 1.644 1:8000 1.047 1: