生物制药工艺学：第七、八章 凝胶层析与膜分离技术.ppt

二、凝胶层析的特点 操作简便、设备简单(仅需一根层析柱)、凝胶不需再生。 分离效果好、重复性高、样品回收率高,接近100%。 分离条件缓和，对分离物的活性无不良影响。 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定类。 外水体积（V0）： 3、柱床体积Vt的测定：加入水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。 4、外水体积Vo测定：可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质 5、内水体积Vo测定：可以通过测定完全进入的大分子物质的洗脱体积来测定常用，铬酸钾作为测定外水体积的物质。 ?排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。 所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。 例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。 例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。 应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。 代表交联度 X越小：交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子产品。 X越大：交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子产品。 代表持水量，每克干胶溶胀时吸水体积的10倍 G-25：1g干胶持水2.5mL G-100：1g干胶持水10mL 凝胶孔径； 分离范围 琼脂糖凝胶做成珠状后不能再脱水干燥 干燥后不能再溶胀恢复原有形状，因此商品在都以含水状态供应，并应在湿态保存。 一般悬浮在103mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。 避免硼酸缓冲液. 洗脱与收集 常采用缓冲盐溶液进行洗脱； 洗脱液的成分不能改变，以防凝胶涨缩引起柱床体积变化或流速改变。 二、分子量测定1 高分子溶液浓缩 通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。 第八章 膜分离技术 概念：用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。 膜 的 类 型 第一节 透析 1.透析和超滤 超过滤（ultrafiltration） 用于除去蛋白或核酸样品中的盐、等小分子物质。 由于透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过通量很小，不适于大规模生物分离过程，而在实验室中应用较多。 透析材料：兽类的膀胱、硝酸纤维素膜、玻璃纸。 人工透析膜多为纤维素的衍生物。 用于透析的半透膜应具备的条件： 在溶剂中能形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过； 化学惰性；在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定； 良好的物理性能：有一定的机械强度和良好的再生性能 超滤技术的优点 1. 超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质的分离、分级、浓缩与富集。 2. 滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，是一种节能环保的分离技术。 3. 对稀溶液中的微量成分的回收、浓缩非常有效。 4. 超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。 超滤过程和装置 外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差极化现象。 错流过滤打破了浓差极化现象，即液体的流向和滤膜相切，使得滤膜的孔隙不容易堵塞。 浓缩和脱盐 分级分离和纯化 除去热源，如产品分子量1000以下，可用截留分子量1万左右的膜比较合适。 先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一线， 再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。 LogM A B C LogM测 V测 * 三、凝胶层析在生化制药中的应用 吸附法除热原的专一性不强。 对SephadexG-25来说，氨基酸Kd值等于1，热原性物质Kd值都等于0。 去除热原 分离纯化 凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨 基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离 提纯。 膜 离子 交换膜 过滤膜 气体 分离膜 新分 离膜 渗析膜 液膜 微滤