生物制药工艺学：第四章 固相析出分离法.ppt

第四章 固相析出分离 第一节 盐析法 第二节 有机溶剂沉淀法 第三节 其他沉淀法 第四节 结 晶 法 生物分离过程的一般流程 浓缩； 初步纯化 ； 由液态变成固态。 第一节 盐析法 在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 表面形成水膜（水化层） ；带相同电荷。 中性盐的亲水性大于蛋白质（酶）的分子的亲水性，加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。 盐溶作用 图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图 第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。 蛋白质浓度对盐析的影响 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量； 蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，影响分离效果； 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低； 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度； 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。 盐析温度的影响 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。 在高浓度下，蛋白质的溶解度随温度上升而下降。 在一般情况下，蛋白质盐析可在室温下进行，对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异； 一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱； 阴离子盐析效果 ：柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN-； 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子； 阴离子的影响大于阳离子； 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠； 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4 ，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：在低温时仍有相当高的溶解度，由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0-4℃）进行。 2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性。有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2-3mol/L浓度(NH4)2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜； 5)废液不污染环境。 1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。 3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。 盐析法结晶肌红蛋白 亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。 水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。 ? 缺点：①有机溶剂沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在低温下进行；②需要耗用大量有机溶剂，成本较高；③有机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。 3、溶液酸碱度的控制 控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分带 有相同电荷;而不要让目的物与主要杂质分子带相同 电荷，以致出现共沉作用。 4、离子强度的控制 用溶剂沉淀蛋白质时离子强度多控制在0.01- 0.05mol/L较好，通常不应超过5%的含量。 常用的助沉剂多为低浓度的单价盐，有醋酸钠、 醋酸铵和氯化钠等。 5、样品浓度的控制