酶组织化学PPT课件2.ppt

* 双底物的反应 * * * * * * * * 以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（NBT）为受H体，其接受H后被还原成紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性。 四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶 * ※ 琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。 SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富△ 抑制物：丙二酸盐（竞争抑制） ——对照 * 【孵育液】0.1M 琥珀酸钠, 0.1M 磷酸盐缓冲液 NBT(硝基蓝四唑) 【步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 孵育液15-35 分钟 3. 生理盐水洗 4. Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟 5. 入80%乙醇5分钟 6. 甘油明胶封固 【结果】 酶活性处为蓝紫色沉淀 * 小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400 * 思考题： 在细胞培养中，常用的MTT法测定细胞活性，用的是什么原理？检测的是什么酶？ * 显示酶的组织化学方法 （二）联苯胺色素法 检测过氧化物酶 酶作用释放的氧使无色的联苯胺脱氢而形成有色的联苯胺蓝，再形成联苯胺褐。 【结果】酶活性处呈棕色 * 过氧化物酶 催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等 髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要 免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂 * 【显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶 【基本原理】过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，DAB），催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀 【作用液】DAB，Tris-Hcl缓冲液，H2O2 【结果】酶活性处呈棕色 * 小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶 *400 * 白血病涂片-过氧化物酶 X400 * 显示酶的组织化学方法 （三）靛酚蓝法（吲哚酚法） 用于检测氧化酶，也可用于细胞色素氧化酶和过氧化物酶等。 把二甲基－对－苯二胺和α－萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者发生结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。 * 如细胞色素氧化酶 * 显示酶的组织化学的其他方法 色素底物法——是将有的色素盐类作为酶的底物，它本身不染组织细胞，但在酶的作用下分解出来的色素却能沉着于酶所在部位。 底物标记法——是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在部位，通过各种方法对此进行检测。 * 酶组织化学的应用 了解组织、细胞的代谢活动 细胞类型的判断 了解细胞定位 用于肿瘤的研究 用于免疫组化和杂交组化的显示手段 * 要求掌握的酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 葡萄糖－6－磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乳酸脱氢酶 琥珀酸脱氢酶 过氧化物酶法 * 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 * 主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ * 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * * * 发现的酶有8000多种,登记的酶有2000多种 * 体内多数酶的最适反应温度是在37℃左右，因而实验损伤中的温度都定在40℃以内，当温度升高至56(60)℃以上时，就可以导致酶的变性、失活 * ACase,腺苷酸环化酶 * * * * 含有重氮基（－N=N+）的盐类 * * 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 ，也是一种四唑盐反应 * * * MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中 MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中 MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中 ② 流水流水洗2分钟后→入蒸馏水 ③ 入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟） ④ 流水洗5分钟，入蒸馏水。 ⑤ 入0.5硫化胺，2分钟。 ⑥ 流水洗10分钟，入蒸馏水。 ⑦ 入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟 ⑧ 流水洗5分钟→蒸馏水。 ⑨ 甘油明胶或Apathy糖胶封固