第9章蛋白质工程.pptVIP

大肠杆菌表达载体必备元件： 第三十一页，共六十页。 目前在原核系统中使用得最普遍的强启动子主要有5个： ① 大肠杆菌的lac启动子： ② 大肠杆菌的trp操纵子的启动子： ③ 将lac启动子的一10区和trp启动子的一35区融合起来的tac启动子； ④ T7噬菌体中基因10的启动子； ⑤ l噬菌体中的左向启动子PL 。 这些启动子都是通过和阻遏蛋白的相互作用，来控制基因转录的启动和停止的。 第三十二页，共六十页。 ?? lac/tac/trc启动子的表达调控 Plac +1 rbs FG Terminator ?? mRNA IPTG 阻遏蛋白 第三十三页，共六十页。 二、 酵母表达系统 例 1：Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是重要的医用酶。大肠杆菌表达体系能将N端的甲硫氨酸除去，但不能将第二个氨基酸(Ala)乙酰化。需用 真核系统表达！ 基因源：人的Cu/Zn-SOD cDNA基因 质粒载体：酿酒酵母 2 mm质粒 启动子：酵母甘油醛磷酸脱氢酶(GAPD)启动子 附加：转录终止信号、poly(A)信号。 宿主细胞：Leu缺陷型的酿酒酵母。 第三十四页，共六十页。 酿酒酵母表达质粒 第三十五页，共六十页。 酿酒酵母表达系统的缺点： 表达水平偏低 表达质粒易丢失 重组蛋白常发生超糖基化 分泌效率差 第三十六页，共六十页。 嗜甲醇的酵母(Pichia pastoris) 优点： 能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。 ? 乙醇氧化酶基因aoxl的启动子是一个很强的诱导型启动子，甲醇诱导时，酶产量可达总蛋白的30％。 ? 毕赤酵母载体包括自主复制的游离载体和整合型载体， 由于没有稳定的附加体质粒， 所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。 宿主细胞为组氨酸脱氢酶缺陷型(HIS4一) 第三十七页，共六十页。 第三十八页，共六十页。 牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表达 牛溶菌酶作用于细菌的细胞壁，具有抗蛋白酶的功能。可用作为促进反刍动物消化的饲料添加剂。 牛溶菌酶前体经P．pastoris正确修饰后分泌到培养基中，分泌的蛋白与天然溶菌酶活性相当，在10 L发酵罐发酵 200 h，产量达 2 g/L 。 第三十九页，共六十页。 丝状真菌 牛溶菌酶基因表达质粒 第四十页，共六十页。 三、丝状真菌表达体系 得到发展主要理由是 ? 丝状真菌的发酵技术成熟，有利于重组蛋白生产 的工业化； ? 丝状真菌具有很强的分泌能力，有望提高重组蛋 白的生产效率； ? 新表达系统的建立可避开大肠杆菌生产重组蛋白 的专利限制； ? 米曲霉和黑曲霉等丝状真菌被FDA和世卫组织认 定安全。 第四十一页，共六十页。 质粒载体元件 第四十二页，共六十页。 在丝状真菌中的选择标记： 营养互补标记：ade(腺嘌呤)、trp等很多。 优点：载体质粒可进行同源整合，易于筛选； 缺点：大多数丝状真菌难获得营养缺陷型。 b. 显性标记：包括药物抗性标记，如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌灵抗性等 c. 细菌的报告基因：在丝状真菌启动子带动下的表达，也可作为选择标记，如 GUS 等。 第四十三页，共六十页。 表达水平： 与多种因素有关，包括选用的启动子及其他调控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷贝数和受体菌株等。 稳定性： 转化子在有丝分裂过程中，多数经过几十代的有丝分裂。但经过减数分裂表现出高度的不稳定。 第四十四页，共六十页。 第三节 蛋白质工程成果及应用 一. 蛋白质工程的成果 在十几年里,蛋白质工程已取得鼓舞人心成果。 1.基础研究方面: 酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP存在的条件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸转移到tRNA的3末端形成酪氨酰tRNA。 第四十五页，共六十页。 研究表明该酶与其底物之间能形成11对氢键,其中8对氢键的形成来源于酶的氨基酸侧链。 1989年,Eersht等人应用蛋白质工程技术对这8个侧链残基进行系统突变以揭示侧链在整个酶促反应中的作用以及对决定酶与底物结合专一性方面的影响。他们还发现酶与过渡态分子的结合力可直接影响酶促反应的速度。 第四十六页，共六十页。 枯草杆菌蛋白酶的蛋白质工程 第四十七页，共六十页。 洗衣粉中对酶的稳定性有影响因素： 表面活性剂：破坏酶的蛋白质结构 漂白剂：化学氧化 第四十八页，共六十页。 抗氧化性结果是Ala222抗氧化性最