常用分子生物学技术的原理及应用.pptxVIP

第二十一章;第 一 节分子印迹与杂交技术;一、核酸分子印迹与杂交技术;(heteroduplex);利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到特定的支持物上，使之成为固相化分子，称之为印迹（blotting）。;（一）Southern印迹杂交;探针（probe） 是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。 ;Southern印迹杂交的基本步骤 ;; 基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。 重组质粒和噬菌体的分析。;（二）Northern印迹杂交;Northern印迹杂交的基本过程 ;放射自显影照片;相同点：;（三）其他核酸杂交方法;二、蛋白质印迹技术(Western blotting);Western blotting应用;Hypoxia - + + + + + + GTE - - - - - - - EGCG - - - - - - - CHX (10μg/mL) - 0 15 30 60 90 180 (min) ;; 首先将混合蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。;蛋白质的转移只有靠电转移 蛋白质的检测以抗体作探针 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。;三种印迹技术的比较; 三种印迹技术的比较;第二节;The Nobel Prize in Chemistry 1993;;;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶) dNTPs Mg2+;PCR反应循环;二、PCR技术的主要特点;2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。;（二）基因的体外定点突变 （三）基因突变分析 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四） DNA和RNA的微量分析 （五） DNA序列测定;The Nobel Prize in Chemistry 1980;G;DNA自动测序结果;反转录PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 ;RT-PCR技术;β-actin 433bp; 原???PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。;实时PCR技术原理;第三节 基因文库 Gene Library;基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) ;一、基因组DNA文库;构建基因组DNA文库的基本过程 ;二、 cDNA文库;基因组文库和cDNA文库的比较 ;第 四 节基因修饰动物模型的建立及应用; 是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。 ;转基因技术 基本原理是采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵的细胞核内或着床前的胚胎干细胞，然后将细胞导入受体动物子宫，使之发育成个体。 ; 即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。; 核转移技术可使一个细胞变成一个个体，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即克隆(clone)。; 通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为基因剔除 (gene knock-out)或基因打靶 (gene targeting)。;四、基因转移和基因剔除在医学中的应用;第 五 节??? 生 物 芯 片 技 术;DNA芯片(DNA chip)、DNA阵列(DNA array) cDNA芯片(cDNA chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作