无缝克隆 同源重组克隆.docx

1.1.1 Gibson assembly 简介（ INTRODUCTION ） 原理： 原理：Gibson assembly 是一种 one step, one pot 的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需 要的三种酶混合在同一个管内在 50°C 下培养 15-60 min 就可以得到组装好的 DNA。 装配原理基于 DNA 片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高 保真 DNA 聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热 DNA 连接酶 （Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化 DNA 片段的链 方向是从 5’到 3’. 每个 DNA 片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以 DNA 片段退火， 互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分 DNA 聚合酶以另一条 DNA 单链为模板，沿 3 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的 DNA 片段就组装成一整条 DNA 分子了。下面是组装的示意图。 材料（ MATERIALS ） 试剂（REAGENTS） NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000， 2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB 培养基、抗生素（据载体而定）、 LB 平板（相应抗性） 实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer NAD 20 mg H2O 300 μL 1 M MgCl2 300 μL 1 M DTT 300 μL 10 mM dNTP mix 600 μL 1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL 50% PEG-8000 3 mL 加水到 7.5 mL，每管分 500 μL 存于-20°C 或-80°C 冰箱,够 3000 个反应 2× assembly mix: best combination: 100 reaction 1 mL 2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL 0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μL Phusion(1× ) 25 μL 4× G.A. buffer 500 μL 加水 365 μL，存于-20°C 冰箱，有效期 1 年。 实验步骤（ PROCEDURE ） 设计引物通过 PCR 设计引物通过 PCR 的方法在 DNA 片段的两端加上同源片段，NEB 推荐同源片段的长度为 15-40 bp，同时要求这部分对应的退火温度高于 4°C。 进行 DNA 纯化：PCR 产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者 PCR 产物回收试剂盒回收。 2. 进行重组反应，以 20 μL 反应体系为例： 组分 加入量 Isothermal assembly Master Mix 10 μL 线性化载体 10-100 ng (1-2 μL) 插入片段 8-9 μL (3-5×载体) Sterilized ddH2O 补足至 20 μL 50°C 反应 15-60 min 反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。 针对性建议 1. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域 GC 含量高于 70%或者低于 30%，重组效率会受到较大影响。 Gibson 组装克隆法缺点之一是适用与长度超过 Gibson 组装克隆法缺点之一是适用与长度超过 200 bp 的片段的组装；缺点之二是如果黏性 末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响。