基因克隆简介.pptx

基因克隆简介;一. DNA分子克隆基础原理;一个完整基因克隆过程包含以下步骤 ;1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目标基因DNA片段。 2. 将带有目标基因外源DNA片段连接到能够自我复制并含有选择记号载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组DNA分子受体细胞，并筛选出已经得到扩增目标基因。 5. 将目标基因克隆到表示载体上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景下实现功效表示，产生出人类所需要物质。;基因克隆简介;二. 用于基因克隆工具酶 ;1.1、限制酶概念提出背景 20世纪30年代，微生物学家发觉，微生物噬菌体不能交叉感染，如E coli K株噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其它株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功效不一样酶，一个是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子一些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体繁殖，另一个是修饰酶，可对自生DNA进行修饰。;;1.2、限制性核酸内切酶命名标准 限制酶命名是采取Smith和Athens提议方案，即名称第个1字母取自它起源细菌属名第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它起源细菌种名头2个字母，小写；假如它起源菌还有株系，则有第4个字母；最终用大写罗马数字，代表同一菌株中不一样限制酶编号。前三个字母用斜体表示。 ;EcoR I;1.3、限制性核酸内切酶分类;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。;（2）切割位点;（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）; ①连接便利;基因克隆简介;2. DNA 连接酶;（1）大肠杆菌连接酶;基因克隆简介;（1）必须是两条双链DNA。; 基因载体是一类能自我复制DNA分子，其中一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目标) DNA而将目标DNA带入宿主细胞。 ;载体具以下特征： 1) 含有自主复制能力； 2）有可选择标识基因（如，抗药基因） 3）有各种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点； 4）分子量小，便于携带较大DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；被切割后???体，插入外源DNA后，不影响其复制能力5）使用安全。克隆载体应只存在有限范围宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，而且不能离开宿主自由扩散。;;1.质粒(plasmid )载体;1、质粒是细菌染色体外能自主复制环形双链DNA分子。 2、编码抗菌素抗性基因质粒叫R质粒。 3、依据每个寄主细胞中质粒拷贝数多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。 4、质粒不亲和性：两种亲缘关系亲密不一样质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存现象。;（1）分子量大，拷贝数低; ?第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 ;基因克隆简介;pBR322质粒载体优点： 　　第一，含有较小分子量。pBR322质粒DNA分子为4 363bp。 　　第二，含有两种抗菌素抗性基因可供作转化子选择记号。 　　第三，具较高拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。这就为重组DNA制备提供了极大方便。 ;基因克隆简介;;第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新筛选标识基因。如pUC系列载体。 ;Ｏ;异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside：IPTG）结构上类似于别乳糖，是乳糖操纵子非常有效诱导物。可诱导lac操纵子表示，但不能被β-半乳糖苷酶水解。;③ Xgal;b-半乳糖苷酶能把无色化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色物质5-溴-4-氯靛蓝。;lacZa肽互补;pUC质粒载体上lacZ’ 编码a肽与这个缺失突变b-半乳糖苷酶“互补”，又能分解Xgal。产生蓝色物质。;a互补插入失活;经过看培养皿上菌斑颜色就能直接知道是否有DNA插入。;基因克隆简介;第三阶段：完善载体功效以满足基因工程克隆中不一样要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6开启子载体，表示型载体及各种探针型载体。; 将某种生物细胞整个基因组DNA切割成大小适当片断，并将全部这些片断都与适当载体连接，引入对应宿主细胞中保留和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体全部基因，称为基因文库。;（2） 基因组文库构建;基因克隆简介; 原