化学发光免疫技术.ppt

关于化学发光免疫技术 第1页，共27页，编辑于2022年，星期五 化学发光免疫技术：集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。 概 念 特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。 第2页，共27页，编辑于2022年，星期五 化学发光免疫技术的类型 按发光剂不同分为 1.发光酶免疫测定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定 第3页，共27页，编辑于2022年，星期五 第一节 发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。 1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。 3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。 第4页，共27页，编辑于2022年，星期五 荧光素酶 ATP；O2；Mg2+ 氧化萤火虫荧光素 萤火虫荧光素 生物发光 返回 光 + AMP+ O2 + CO2 + 第5页，共27页，编辑于2022年，星期五 化学发光 机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 二、化学发光剂 化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂 第6页，共27页，编辑于2022年，星期五 ①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； ③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。 化学发光剂应符合以下几个条件 返回 第7页，共27页，编辑于2022年，星期五 1.酶促反应的发光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 1.1 鲁米诺 H2O2 /OH — HRP +N2 + H2O +光 第8页，共27页，编辑于2022年，星期五 对-羟基苯乙酸（HPA） HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。 1.2 HPA H2O2 HRP +荧 光 氧化二聚体 第9页，共27页，编辑于2022年，星期五 AMPPD AMPPD在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的 AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发 出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度 达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定。 光 AP /OH — HPO4 2— 1.3 AMPPD 第10页，共27页，编辑于2022年，星期五 4-MUP 发出448nm的荧光4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的 激发光的作用下，，可用荧 光光度计进行测量。 荧光 AP 1.4 4-MUP 4-MU 360nm 激发光 H3PO4 + 第11页，共27页，编辑于2022年，星期五 2.直接化学发光剂 特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE） + CO2+ 光 第12页，共27页，编辑于2022年，星期五 3.电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。 特点：①反应在电极进行； ②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌 返回 三联毗啶钌 分子结构图 第13页，共2