STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用.docVIP

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用 1 1 材料和方法 2 2 结果 5 3 讨论 6 文2：STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用临床医学论文 7 1 材料和方法 8 2 结果 11 3 讨论 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 15 正文 STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用 文1：STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用 信号转导子及转录活化子（signal traduce and activato of tracription， STATs）是细胞因子和生长因子受体信号的下游效应物， 在细胞核内与特异性的DNA启动子结合， 调节相关基因的表达［1］。在哺乳动物7个STAT家族成员中， STAT3是近年来研究异常活跃的转录因子。STAT3已被确认为是癌基因［2］， 在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达［3］， 与肿瘤增殖分化、 细胞凋亡、 新血管生成和免疫逃逸密切相关［4］。阻断STAT3信号转导通路可抑制胰腺癌细胞增殖功能［5］。本研究中利用RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术， 以U6neo载体中的U6为启动子， STAT3为靶基因， 构建STAT3siRNA表达载体， 转染人宫颈鳞癌SiHa细胞， 抑制STAT3基因表达， 观察SiHa细胞增殖和凋亡的变化。 1 材料和方法 材料 人宫颈癌细胞株SiHa细胞购自武汉典型生物保藏中心， 胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司， RPMI1640培养液（Gibco）、 质粒U6neo（Ambion）、 DH5α为清华天为时代公司产品， 质粒小提取试剂盒购自北京博克泰克公司， 凝胶回收试剂盒和质粒大提取试剂盒购自Qiagen公司， Lipofectimane 2000脂质体转染试剂盒、 FITCannexin V凋亡试剂盒和cDNA逆转录试剂盒购自Invitrogen公司， 各种工具酶购自TaKaRa公司， STAT3单克隆抗体（mAb）购自Santa cruz公司， MTT试剂购自Sigma公司， PCR引物和短发夹RNA（Short hairpin RNA， shRNA）表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成， STAT3 shRNA表达载体测序由大连亚法生物技术公司完成。 方法 STAT3特异性shRNA转录模板的设计及合成 根据GenBank中STAT3人全长cDNA序列（）， 参考相关文献选取特异性的序列为干扰作用的靶点［6］， 加入9 bp的环结构， U6启动子终止序列， 并引入两个酶切位点， 以确保退火后可以插入质粒U6neo中且读框正确。采用国际通用的与所有基因均无同源性序列的nontarget siRNA作为阴性对照。人工合成一对互补并编码短发状siRNA的寡核苷酸链序列如下: STAT3 正义 5′GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTT TGTCGACA3′， 反义5′AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAG TCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG3′。 阴性对照正义 5′GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGTCGACA3′， 反义5′AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCT TGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG3′ 重组质粒的构建和瞬时转染 将上述的DNA片段退火， 用T4连接酶连接于经双酶切（Hind III， BamH I）的质粒U6neo中， 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α， 涂于氨苄抗性（终浓度为50 mg/L）的LB培养基上， 次日随机挑取菌落， 接种于LB培养液中， 振荡过夜， 碱裂解法快速抽提质粒， 紫外分光光度法定量。SiHa细胞在含100 mg/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液中， 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。取对数生长期细胞接种于6孔板， 密度达80%时， 用Lipofectamine 2000转染重组质粒， 转染6 h后更换含200 mg/L FBS培养液继续培