食管癌细胞黏附侵袭和迁移能力受XIAP基因的影响研究.docVIP

食管癌细胞黏附侵袭和迁移能力受XIAP基因的影响研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：食管癌细胞黏附侵袭和迁移能力受XIAP基因的影响研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 6 文2：熊果酸对卵巢癌细胞黏附运动和侵袭的影响 8 1 材料与方法 8 2 结 果 10 3 讨 论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 食管癌细胞黏附侵袭和迁移能力受XIAP基因的影响研究 文1：食管癌细胞黏附侵袭和迁移能力受XIAP基因的影响研究 食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家[1]。食管癌的发生是一个涉及多基因、多因素的复杂过程，研究这些变化对于 阐明食管癌发生机制具有重要意义。X连锁凋亡抑制蛋白(X linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制蛋白家族(IAP)的主要成员，在多种实体肿瘤中呈现高表达，其表达与肿瘤发生发展密切相关[2]。研究显示，抑制XIAP表达可明显降低胰腺癌细胞侵袭迁移和EMT[3];MicroRNA-212可通过靶向XIAP抑制肾癌细胞增殖、侵袭和迁移能力[4]。已有研究表明，食管癌组织XIAP表达明显高于正常食管组织，通过siRNA抑制XIAP表达后可明显诱导癌细胞凋亡[5]。但目前XIAP对食管癌细胞黏附、侵袭和迁移影响及机制尚且清楚。鉴于此，本研究采用脂质体介导转染技术将设计合成的XIAP特异性siRNA转染食管癌细胞，检测转染后XIAP表达情况，并分析抑制XIAP表达对癌细胞活力、黏附、侵袭和迁移的影响，并进一步探讨其作用机制。以期为食管癌的诊疗提供理论依据。 1、材料与方法 试剂和仪器 RPMI1640培养基、FBS、BSA均购自美国Gibco;XIAP、AKT、p-AKT、E-cadherin和MMP-2抗体均购自美国CST;MTT、DMSO均购自美国Sigma;Trawell小室购自美国BD;酶标仪购自美国BioRAD。 细胞培养及siRNA转染 人食管癌EC9706细胞株购自美国ATCC。EC9706细胞常规复苏后，使用含10%FBS的RPMI1640完全培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱培养。转染参照LipofectamineTM2000说明。以5×104个/孔将生长至对数期的EC9706细胞铺于6孔板，使用无抗生素的培养基培养24 h，使转染时的细胞达80%～90%生长融合度，制备Lipo 2000-siRNA复合物，将复合物加入6孔板相应的孔内，于5%CO2、37℃恒温培养箱孵育6 h，更换含血清的培养基，继续培养48 h，Western blotting检测转染效果。实验分组:空白组(仅加入等量的脂质体)、NC组(转染阴性对照siRNA)和si-XIAP组(转染XIAP的特异性siRNA) Western blotting实验 收集转染siRNA 48 h的EC9706细胞，加适量RIPA裂解液，在冰上充分裂解反应30 min，离心，吸取上清。BCA法测定蛋白浓度。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，按照50μg/孔上样，常规电泳后，电转凝胶至PVDF膜，随后将膜用5%脱脂奶粉在室温条件下封闭1 h，加TBST稀释的一抗(XIAP、AKT、p-AKT、E-cadherin和MMP-2抗体，均为1∶500稀释)，4℃过夜，TBST洗膜，加5%脱脂奶粉稀释的HRP标记的二抗(1∶3 000稀释)，室温孵育2 h，将ECL显色液滴加至PVDF膜上，反应1 min，用塑料袋包好，将PVDF膜放于X光片暗盒，在暗室中压片、显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。实验重复3次。 MTT实验 以5 000个/孔密度接种生长至对数期的EC9706细胞于96孔板，每孔100μl细胞悬液，于培养箱内常规孵育24 h，将阴性对照siRNA和XIAP的特异性siRNA转染细胞，未转染的细胞作为空白组，每组设置5个平行孔，分别培养24 h、48 h和72 h，在各孔中加入20μl MTT溶液(5 mg/ml)，于培养箱内继续培养4 h终止培养。吸弃孔内培养上清液，加入150μl的DMSO，震荡15 min，以使结晶能够充分溶解。酶标仪测定各孔吸光度值(A)，测定波长570 nm。实验重复3次。 细胞黏附实验 在96孔培养板孔内分别滴加50μl 80μg/ml Matrigel胶及FN，使之能覆盖整个孔底，室温过夜干燥。次日，在96孔板中加含2%BSA的培养基，每孔加100μ